發(fā)形霞水母觸手提取物細胞毒性.pdf

1、隨著海洋資源的開發(fā)利用和水母數(shù)量的增多，水母傷人事件越來越多，有毒水母蜇傷成為最常見的海洋生物傷。水母毒素是一類結(jié)構(gòu)新穎的肽類毒素，相對分子量從10～600 kDa不等，文獻報道的活性成分差異顯著。研究發(fā)現(xiàn)水母毒素具有細胞、心血管、神經(jīng)、肌肉、呼吸、循環(huán)、酶和皮膚壞死等多種生物活性，其中細胞毒性是水母毒素最具普遍意義的生物活性，在水母蜇傷中毒中起重要作用。目前水母毒素研究主要集中在毒素對整體動物或離體臟器功能的影響等方面，更深入的細胞毒

2、性作用及其機制尚無明確報道，有待進一步研究。本文初步探討了TOE體內(nèi)外溶紅細胞毒性作用及其作用機制，提出稀釋的全血是一種比紅細胞懸液更加方便有效的溶血活性測定系統(tǒng)，并分析了TOE對4種離體細胞的毒性效應，測定毒素作用后細胞中Ca2+、ATPase、MDA等各個指標的變化，旨在從細胞水平研究TOE的毒性作用。
　　 方法為：首先，以紅細胞為代表檢測TOE的溶細胞活性(溶血活性)，體外比較SD大鼠稀釋的全血與紅細胞懸液的溶血活性差異

3、，觀察各種金屬陽離子對溶血活性的影響；體內(nèi)追蹤TOE的溶血過程。觀測TOE對紅細胞滲透脆性的影響，電鏡觀察紅細胞膜的變化，SC5b-9測定試劑盒檢測其在毒素作用前后活性水平。將稀釋全血和紅細胞懸液兩套測試系統(tǒng)擴展到包括人在內(nèi)的其它幾種動物血樣進行比較研究，觀察抗氧化劑對溶血活性的影響，驗證全血測試系統(tǒng)的實用性，利用血漿和血清白蛋白干預探討溶血的可能機制。其次，原代培養(yǎng)SD大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)，與多種腫瘤細胞相比較，MTT法檢

4、測TOE對所培養(yǎng)細胞生存率的影響，測定LDH進一步反映TOE的細胞毒性作用，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。利用熒光探針Fluo-3觀測TOE作用后細胞內(nèi)Ca2+的動態(tài)變化，利用試劑盒分別測定正常細胞與TOE作用后細胞Ca2+、ATPase、MDA、NO等水平的變化。分別取TOE作用前后大鼠胸主動脈血管，組織勻漿后測定Ca2+含量變化。
　　 結(jié)果表明，TOE的溶血活性在大鼠稀釋全血和紅細胞懸液兩個測試系統(tǒng)中都具有劑量依賴性，且紅細

5、胞懸液中的溶血活性高于稀釋全血。Mn2+，Zn2+，La3+，Cu2+和Fe2+能顯著抑制TOE的溶血活性。當給予TOE(5 mg/kg i.v.)后，麻醉SD大鼠血清OD414在前10 min顯著快速上升，在接下來的3小時內(nèi)逐漸升高。最大和最小紅細胞滲透脆性在加入TOE(5 mg/kg i.v.)后隨著時間延長明顯增加。透射電鏡觀察給予TOE(5mg/kg)30 min后的SD大鼠的動脈血細胞樣本，發(fā)現(xiàn)在一些正常形態(tài)的紅細胞表面有大量

6、未知的復合物。體外SC5b-9復合物在與TOE共培養(yǎng)后呈顯著性上調(diào)，而靜脈給予TOE(5 mg/kg)180 min內(nèi)未見顯著性差異。利用稀釋全血和紅細胞懸液兩套溶血測試系統(tǒng)做比較研究發(fā)現(xiàn)，紅細胞懸液中的溶血活性普遍高于稀釋的全血?？寡趸瘎〨SH和VC能抑制TOE的溶血活性，蛋白酶抑制劑對溶血活性影響不明顯。血清和單純的血漿成分—白蛋白對溶血活性有明顯劑量依賴性的抑制作用。MTT法檢測結(jié)果表明，TOE對4種貼壁細胞均產(chǎn)生細胞毒性作用，且

7、原代培養(yǎng)的VSMCs比3種腫瘤細胞對毒素作用更為敏感。毒素作用后，VSMCs上清中LDH活性較正常細胞上清液明顯升高。鏡下觀察不同濃度TOE作用24 h后各組細胞的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，隨TOE劑量的升高，細胞漂浮、腫脹、折光性差等變化更加明顯，大量細胞破裂、崩解、死亡。Fluo-3追蹤TOE作用后VSMCs胞內(nèi)Ca2+的動態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，10 min內(nèi)胞內(nèi)Ca2+出現(xiàn)明顯的升高過程，隨之進入平原期，1小時后又一次較大幅度的升高。TOE作用后勻漿細胞中

8、Ca2+水平升高，而Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活性沒有明顯變化，MDA及NO變化也不明顯。TOE作用后SD大鼠血管平滑肌組織勻漿也顯示了Ca2+升高的變化趨勢。
　　 本文首次同時使用稀釋全血和紅細胞懸液兩套測試系統(tǒng)進行體外溶血活性檢測，發(fā)現(xiàn)TOE在紅細胞懸液中的溶血活性普遍高于稀釋的全血，表明血漿中白蛋白成分可能具有溶血保護作用。TOE在體內(nèi)的溶血過程分為兩個階段：第一階段為快速直接的溶血，隨后是漸進的

9、溶血，體內(nèi)溶血與體外溶血的過程是不一致的。綜合多種陽離子和抗氧化劑對溶血活性的影響、紅細胞滲透脆性實驗、透射電鏡觀察、SC5b-9活性測定等實驗結(jié)果，推測氧化損傷和孔道形成在TOE的溶血過程中起主要作用。采用原代培養(yǎng)VSMCs細胞檢測TOE對細胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn)與腫瘤細胞相比，VSMCs細胞對TOE最為敏感，這進一步證明水母毒素作用靶點主要是心血管。TOE作用后胞內(nèi)鈣水平出現(xiàn)升高-平衡-升高的動態(tài)變化過程，說明胞內(nèi)Ca2+升高可能首先是