發(fā)形霞水母觸手提取物的心臟毒性及其作用機(jī)制探討.pdf

1、近年來，由于氣候變暖與富營養(yǎng)化等因素的影響，全球近海海域水母爆發(fā)日益頻繁[1，2，3，4，5];隨著海洋資源開發(fā)力度的加大和海洋產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，人類與有毒水母接觸的機(jī)會也不斷增多，水母蜇傷成為最常見的海洋生物傷[6,7]。水母蜇傷會產(chǎn)生劇烈疼痛、炎癥與壞死等局部癥狀，嚴(yán)重者會出現(xiàn)肌肉痙攣、呼吸、循環(huán)系統(tǒng)抑制甚至休克等全身中毒癥狀，急性心力衰竭被認(rèn)為是水母蜇傷致死的主要原因[4，8]。研究表明水母毒素對心血管、神經(jīng)、肌肉、肝、腎等多器官系

2、統(tǒng)具有毒性作用，其中心血管毒性被認(rèn)為是水母毒素毒力強(qiáng)弱的主要判斷依據(jù)[9]，但迄今水母毒素心血管毒性的作用機(jī)制尚不清楚。本文中，我們首先在離體心臟水平證明發(fā)形霞水母（Cyanea capillata）觸手提取物(tentacle extract，TE)具有直接的心臟毒性作用;然后對TE心臟毒性的作用機(jī)理進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CICR（Ca2+-induced Ca2+ release）信號通路在TE引起的急性心功能異常中起著重要的作用，β腎上

3、腺素受體-cAMP-PKA-RyR2-Ca2+信號通路也與TE引起的急性心功能異常有關(guān)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 第一部分:離體心臟水平TE直接心臟毒性作用的研究
　　 用Langendorff-Perfused離體心臟模型監(jiān)測TE作用后各種心功能指標(biāo)(心率(heart rate，HR)、左心室發(fā)展壓（left ventricular developed pressure，Lvdp）、左心室壓上升與下降的最大變化

4、速率(the positive and negative derivatives of left ventricularpressure，±dP/dtmax)、冠脈流量(coronary flow，CF)、左心室舒張末壓(left ventricularend diastolic pressure，Lvedp))以及心電圖(electrocardiogram，ECG)的變化;采用自動生化分析儀測定TE作用后心臟損傷相關(guān)酶(乳酸脫氫酶(l

5、actate dehydrogenase，LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)）的變化;并觀察TE作用后心臟出現(xiàn)的病理學(xué)變化。預(yù)先給予不同種類的藥物（二氫吡啶類Ca2+通道拮抗劑硝苯地平（0.25μM）與苯烷胺Ca2+通道拮抗劑維拉帕米(0.1μM)，非選擇性β腎上腺素受體阻斷劑普奈洛爾（1μM）與非選擇性α腎上腺素受體阻斷劑酚妥拉明（1μ

6、M），非選擇性毒蕈堿受體拮抗劑阿托品（1.5μM）或可逆性膽堿酯酶藥物新斯的明(3.3μM)）后，分別觀察TE對離體心臟心功能指標(biāo)的影響。
　　 第二部分:TE心臟毒性作用機(jī)制的探討
　　 在整體動物與離體心臟水平檢測TE作用后各心功能指標(biāo)的變化，在心肌細(xì)胞水平觀察TE對乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)、存活率以及細(xì)胞內(nèi)心肌酶的影響。用Ca2+檢測試劑盒檢測TE作用后心臟組織中Ca2+含量的變化，激光掃描共聚焦技術(shù)檢測TE作用后乳鼠心肌

7、細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量及細(xì)胞形態(tài)的變化。觀察不同陽離子通道阻斷劑（13種）干預(yù)后，TE對乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響，篩選出有效拮抗TE心肌細(xì)胞毒性的藥物，進(jìn)一步在離體心臟與整體動物水平驗(yàn)證其對TE心臟毒性的拮抗作用。然后綜合分析CICR信號通路在TE心臟毒性作用中的機(jī)制。
　　 我們還在心肌細(xì)胞水平，用western blot技術(shù)檢測TE作用后細(xì)胞內(nèi)β1-腎上腺素受體(β1-adrenergic receptor，β1-AR)蛋白表達(dá)

8、量的變化。酶聯(lián)免疫(enzyme linkedimmunosorbent assay, Elisa)法檢測TE作用后乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的變化，以及β腎上腺素受體阻斷劑（普奈洛爾、阿替洛爾、艾司洛爾）干預(yù)后TE對細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的影響。在細(xì)胞外不含Ca2+的條件下用PKA(protein kinase A，PKA)抑制劑H89干預(yù)后觀察TE對乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響。初步探討β腎上腺素-cAMP-PKA-RyR2-Ca2+信號通

9、路在TE心臟毒性作用中的機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 第一部分:離體心臟水平TE直接心臟毒性作用的研究
　　 TE劑量分別為60、120、180、240μg時，心功能指標(biāo)HR、Lvdp、±dP/dtmax、CF呈明顯的劑量依賴性降低，Lvedp呈明顯的劑量依賴性增加;ECG也出現(xiàn)明顯的劑量與時間依賴性變化。當(dāng)TE劑量大于240μg時，心臟會出現(xiàn)嚴(yán)重的心律不齊（心室顫動或者高度房室傳導(dǎo)阻斷），15min后驟停。在

10、TE劑量為180μg時，心臟損傷相關(guān)酶LDH、AST、CK明顯增加;組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)心臟出現(xiàn)多種損傷:波狀纖維、心肌細(xì)胞直徑不規(guī)則以及間質(zhì)水腫。硝苯地平與維拉帕米可以明顯改善TE引起的心臟損傷，普奈洛爾與酚妥拉明可部分改善TE引起的心臟損傷，但是阿托品與新斯的明對TE引起的心臟損傷沒有明顯作用。
　　 第二部分:TE心臟毒性作用機(jī)制的探討
　　 在整體動物與離體心臟水平，TE均可導(dǎo)致心功能指標(biāo)發(fā)生明顯變化;在乳鼠心肌細(xì)

11、胞水平，TE作用后細(xì)胞的存活率呈劑量與時間依賴性下降。激光掃描共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞外含Ca2+（1.27 mmol/L）與不含Ca2+的條件下，TE都可引起心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，并且細(xì)胞外含Ca2+條件下比不含Ca2+時Ca2+增加更迅速(＜5 min)，達(dá)到Ca2+峰值的時間更早(約10 min)，細(xì)胞形態(tài)變化更明顯。利用多種離子通道阻斷劑對TE的心肌細(xì)胞毒性作用進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)L-型Ca2+通道(L-type Ca2+ channe

12、l，LTCC)阻斷劑（如地爾硫卓）可明顯提高心肌細(xì)胞的存活率，用RyR2拮抗劑(ryanodine)干預(yù)后心肌細(xì)胞的存活率也明顯提高，提示TE的心臟毒性可能與CICR信號通路有關(guān);地爾硫卓在離體心臟與整體動物水平也可以明顯拮抗TE引起的急性心功能異常，進(jìn)一步說明CICR信號通路在TE的心臟毒性中起著重要作用。
　　 TE作用心肌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)β1-AR的蛋白表達(dá)量與cAMP的濃度呈明顯的劑量依賴性增加，提示TE的心臟毒性可能與過

13、度激活β腎上腺素-cAMP-PKA-RyR2-Ca2+信號通路有關(guān);β腎上腺素受體阻斷劑（普奈洛爾、阿替洛爾、艾司洛爾）干預(yù)后，可以明顯拮抗TE引起的心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的增加;在細(xì)胞外不含Ca+的條件下用PKA抑制劑H89進(jìn)行干預(yù)，可明顯提高TE作用后乳鼠心肌細(xì)胞的存活率。進(jìn)一步表明β腎上腺素受體-cAMP-PKA-RyR2-Ca2+信號通路可能也是TE引起心功能異常的重要作用機(jī)制之一。
　　 結(jié)論:
　　 1.在離