光動力學療法對小鼠Heps肝癌移植瘤免疫及微血管效應的實驗研究.pdf

1、目的: 觀察光動力學療法(photodynamic therapy，PDT)對荷Heps肝癌移植瘤小鼠腫瘤生長及生存期、腫瘤局部及全身免疫效應、腫瘤微血管及腫瘤細胞促血管生成因子表達的影響，探討PDT的免疫和微血管效應機制，為臨床肝癌PDT提供實驗依據。觀察PDT聯合CpG寡聚脫氧核苷酸(cytosine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotides，CpG ODN)局部治療，對腫瘤生長及免疫效應的

2、影響，探討聯合治療的療效和作用機制，為肝癌綜合治療提供新方法。 方法: 接種Heps肝癌細胞于ICR小鼠皮下，建立Heps肝癌移植瘤模型。移植瘤長徑達0.9～1.2cm時，隨機分為荷瘤對照組、免疫治療組、PDT組和光動力免疫治療(photodynamic immunotherapy，PDIT)組，每組均為28只小鼠。免疫治療組于小鼠腫瘤局部注射CpG ODN100μg。PDT組于治療前1日經小鼠尾靜脈注入光敏劑PSD-007 2

3、0mg/kg，避光24小時后照射腫瘤局部。激光波長632.8nm，光斑直徑2cm，功率密度為240～250mW/cm2，能量密度為215～225J/cm2。PDIT組于PDT后即刻腫瘤局部注射CpG ODN100 μg。(1) 自治療當日起，隔日測量四組小鼠腫瘤長、短徑，計算腫瘤體積和治療后16天的抑瘤率。(2) 記錄接種腫瘤當天開始至小鼠死亡的時間，計算各組小鼠平均生存時間。(3) 于治療后2小時、6小時、24小時和72小時，各組分批

4、處死5只小鼠。取腫瘤組織，石蠟包埋并切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-esosin，HE)染色后光學顯微鏡觀察。(4) 取各組小鼠上述時間點的腫瘤組織切片，分別應用F4/80抗體、CD8抗體、CD34抗體和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體，行免疫組織化學染色。計數局部腫瘤組織中巨噬細胞、CD8+T細胞數量和微血管密度(microvessel density，

5、MVD)值，并應用圖像分析軟件，對腫瘤細胞VEGF表達強度進行半定量分析。(5) 取各組小鼠上述時間點的血清，通過雙抗體夾心法酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，檢測干擾素(interferon，IFN)-γ和白介素(interleukin，IL)-12p70的水平。 結果: 1.免疫治療組治療后8天、16天，腫瘤體積較荷瘤對照組明顯縮小(P<0.01)。P

6、DT組和PDIT組治療后48小時，腫瘤體積即較荷瘤對照組明顯縮小(P<0.05)；治療后8天、16天，腫瘤體積較荷瘤對照組及免疫治療組均顯著縮小(P<0.01)。PDIT組治療后8天及16天，腫瘤體積較PDT組縮小更為顯著(P<0.05)。免疫治療組、PDT組和PDIT組治療后16天的抑瘤率，分別為19.20％、96.26％、97.76％。 2.荷瘤對照組、免疫治療組、PDT組和PDIT組小鼠平均生存時間，分別為22.50±6.

7、48天、24.75±9.32天、72.25±12.23天、80.00±13.91天。免疫治療組小鼠生存時間，較荷瘤對照組無明顯差異(P>0.05)。PDT組和PDIT組小鼠生存時間，較荷瘤對照組及免疫治療組均明顯延長(P<0.01)。PDIT組小鼠生存時間，較PDT組稍有延長，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 3.HE染色結果顯示，荷瘤對照組腫瘤細胞呈巢片狀生長，壞死區(qū)少見，腫瘤組織中浸潤少量炎癥細胞。免疫治療組治療后2小時

8、、6小時，腫瘤壞死較荷瘤對照組無明顯變化；治療后24小時、72小時，見小片狀壞死區(qū)，炎細胞浸潤較荷瘤對照組增多。PDT組治療后2小時腫瘤細胞主要為空泡樣變性，微血管擴張淤血；治療后6小時腫瘤細胞空泡樣變性、核固縮較前加重，微血管高度擴張，血液淤滯；治療后24小時腫瘤細胞大片壞死，微血管破壞，腫瘤組織間可見彌散出血；治療后72小時腫瘤組織大片凝固性壞死，微血管完全破壞，僅周邊區(qū)域見少數殘存微血管，周圍環(huán)繞變性腫瘤細胞，腫瘤組織中可見大量炎

9、癥細胞浸潤。PDIT組治療后72小時，腫瘤細胞壞死情況和微血管變化與PDT組相似，炎癥細胞浸潤更為明顯。 4.免疫組化染色結果顯示，免疫治療組治療后24小時、72小時，腫瘤局部巨噬細胞數量明顯高于荷瘤對照組(P<0.01)。PDT組治療后2小時、6小時及72小時，PDIT組治療后2小時、6小時、24小時和72小時，腫瘤局部巨噬細胞數量，較荷瘤對照組及免疫治療組均明顯增多(P<0.01或P<0.05)。PDT組治療后24小時，腫瘤

10、局部巨噬細胞較6小時有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，仍明顯高于荷瘤對照組(P<0.01)。上述時間點，PDIT組腫瘤局部巨噬細胞數量顯著高于PDT組(P<0.01或P<0.05)。 免疫治療組治療后72小時，癌巢內CD8+T細胞數量，較荷瘤對照組明顯增多(P<0.01)。PDT組也于治療后72小時，癌巢內CD8+T細胞數量顯著增多，與荷瘤對照組和免疫治療組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01).PDI

11、T組治療后72小時，癌巢內CD8+T細胞數量，較荷瘤對照組、免疫治療組和PDT組均明顯增多(P<0.05或P<0.01). PDT后2小時～72小時，腫瘤區(qū)MVD進行性下降。治療后2小時，腫瘤MVD即明顯低于荷瘤對照組(P<0.01)；治療后6小時較2小時有所下降，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后24小時，腫瘤MVD較6小時顯著降低(P<0.05)；治療后72小時，殘存微血管數量極少。 PDT后2小時～72小時，

12、腫瘤細胞VEGF表達較荷瘤對照組明顯升高(P<0.01).治療后6小時，腫瘤細胞VEGF表達強度達最高值，顯著高于治療后2小時、24小時和72小時(P<0.01、P<0.05、P<0.01)。 5.ELISA結果顯示，免疫治療組治療后24小時、72小時，血清IL-12p70的濃度較荷瘤對照組明顯升高(P<0.01)；治療后72小時，血清IFN-γ的濃度較荷瘤對照組明顯升高(P<0.01)。PDT組和PDIT組治療后2小時～72小

13、時，血清IL-12p70的濃度，顯著高于荷瘤對照組和免疫治療組(P<0.01)。PDT組治療后72小時，PDIT組治療后24小時、72小時，血清IFN-γ的濃度也較荷瘤對照組和免疫治療組明顯升高(P<0.01或P<0.05)。PDIT組較PDT組升高更為顯著(P<0.01或P<0.05)。 結論: 1.PDT可有效殺傷肝癌細胞，顯著抑制腫瘤生長，明顯延長荷瘤小鼠的生存時間。 2.PDT可誘導巨噬細胞和CD8+T細