自然殺傷細胞對小鼠Heps肝癌移植瘤的抑制作用及機理探討.pdf

1、目的：研究自然殺傷細胞(NK)對原發(fā)性肝癌Heps移植瘤小鼠的增殖抑制作用和機理探討。
　　 方法：誘導擴增昆明小鼠脾細胞來源的NK細胞，體外培養(yǎng)誘導NK細胞。隨機取60只8-12周齡雄性昆明小鼠，接種Heps肝癌細胞于其背側(cè)皮下，建立Heps肝癌移植瘤模型。將模型鼠隨機分為4組（每組15只）：①生理鹽水(NS)對照組，此組小鼠每只注射NS對照組0.1ml，隔日注射，共3次；②NK細胞治療組1,此組小鼠每只注射3×105/ml的

2、NK細胞0.1ml(即每只小鼠注射NK細胞3X104個)，隔日注射，共3次；③NK細胞治療2，此組小鼠每只注射3×106/ml的NK細胞0.1ml(即每只小鼠注射NK細胞3×105個)，隔日注射，共3次；④NK細胞治療組3，此組小鼠每只注射3×107/ml的NK細胞0.1ml(即每只小鼠注射NK細胞3×106個)，隔日注射，共3次。其中，每組各有10只單獨用于觀察生存期。(1)自注射日起，隔日測量各組小鼠腫瘤長、短徑，計算注射后腫瘤體積

3、。(2)記錄注射當天開始至小鼠死亡的時間，計算各組小鼠平均生存時間。(3)于注射后第15d,各組分別處死5只小鼠。取腫瘤組織，石蠟包埋并切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-esosin,HE)染色后光學顯微鏡觀察。(4)于第15d取小鼠脾臟制成脾細胞懸液，用流式細胞術(shù)(Flow CytoMeter,FCM)檢測NK細胞比例。(5)于第15d取小鼠脾臟制成脾細胞懸液，以小鼠Heps肝癌細胞為靶細胞，乳酸脫氫酶(lactatedeh

4、ydrogenase,LDH)釋放法檢測小鼠脾細胞細胞毒活性。(6)取各組小鼠腫瘤組織切片，分別應用Bcl-2抗體、Bax抗體和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體，行免疫組織化學染色。計數(shù)局部腫瘤組織中Bcl-2陽性、Bax陽性細胞數(shù)量，并應用圖像分析軟件對腫瘤細胞VEGF表達強度進行半定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1．成功誘導擴增小鼠脾細胞來源NK細

5、胞。
　　 2．小鼠Heps肝癌腹水瘤細胞成功制備小鼠Heps肝癌移植瘤模型，成瘤率100％。
　　 3．小鼠Heps肝癌腹水瘤細胞接種于到昆明小鼠背側(cè)皮下，并同時給各組小鼠回輸不同濃度的NK細胞以及生理鹽水，隔日測量各組小鼠腫瘤的的大小，第20d,治療1組小鼠腫瘤的體積(1757 mm3)較對照組(5012mm3)明顯減小(P＜0.01)。
　　 4．回輸后60d時，治療1組最后一只小鼠死亡，而其余各組小鼠均早

6、已死亡，治療1組小鼠的生存期（平均生存期41天）較對照組（平均生存期20d）、治療3組（平均生存期18d）顯著延長(P＜0.01），較治療2組（平均生存期21d）也明顯延長(P＜0.05）。
　　 5．各組小鼠腫瘤HE染色治療1組、2組、3組小鼠腫瘤細胞形態(tài)消失，壞死明顯，組織中炎性細胞浸潤明顯，血管較NS對照組少。
　　 6．各組小鼠脾細胞中NK細胞的含量第15d脾細胞懸液FACS檢測NK細胞比例，隨著注射NK細胞濃度

7、的升高，脾細胞中NK細胞的含量逐漸增高，各治療組與對照組均有顯著差別（P＜0.01），但是各治療組之間無明顯差別。
　　 7．各組小鼠脾細胞的細胞毒活性荷瘤小鼠脾中NK細胞殺傷活性隨濃度增高而增強。效靶比為10:1及20:1時，各治療組NK細胞殺傷活性明顯高于NS對照組(P＜0.01），而各治療組間沒有明顯差異。
　　 8．各組小鼠腫瘤Bcl-2-IHC染色：回輸后15d，治療1組、2組Bcl-2蛋白表達明顯低于對照組及

8、治療3組(P＜0.05）。
　　 9．各組小鼠腫瘤Bax-IHC染色：回輸后15d，治療1組Bax蛋白表達明顯高于對照組及治療2組、3組(P＜0.05）。
　　 10．各組小鼠腫瘤VEGF-IHC染色：回輸后15d，治療1組VEGF表達明顯低于對照組及治療2組、3組(P＜0.05)。
　　 11．細胞免疫治療的副反應回輸后11d，治療3組小鼠死亡3只，治療2組死亡2只，治療1組小鼠活動良好，未見特殊不良反應。