高糖高脂刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生微囊泡及初步機(jī)制.pdf

1、目的：糖尿病高凝狀態(tài)導(dǎo)致的血栓形成傾向在血管并發(fā)癥中起重要作用，微囊泡(MV)是導(dǎo)致糖尿病高凝狀態(tài)的最新因子，在動(dòng)脈血栓形成過(guò)程中其重要作用，而氧化應(yīng)激是糖尿病和微囊泡產(chǎn)生的重要共同機(jī)制。本研究中以體外培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象，研究2型糖尿病重要的生化特征即高糖和高脂狀態(tài)下單核細(xì)胞能否產(chǎn)生微囊泡及其初步機(jī)制，為糖尿病血管血栓形成導(dǎo)致血管病變的發(fā)生發(fā)展提供新的理論基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴采用ELISA技術(shù)檢測(cè)高糖高脂刺激THP

2、-1細(xì)胞20小時(shí)后MV含量，并檢測(cè)ERK抑制劑U0126及抗氧化劑NAC預(yù)處理1h對(duì)高糖高脂刺激THP-1細(xì)胞產(chǎn)生MV含量的變化。⑵采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)高糖高脂處理2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)后MAPK通路中 p-ERK、ERK、p-p38、p38蛋白表達(dá)的變化。⑶采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)高糖高脂處理20小時(shí)后細(xì)胞凋亡率的變化及高糖高脂處理不同時(shí)間后細(xì)胞內(nèi)ROS的變化。
　　 結(jié)果：①ELISA結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，30m

3、M葡萄糖與25μg/mL ox-LDL刺激THP-1細(xì)胞20小時(shí)后MV產(chǎn)生顯著增多(P＜0.01);抗氧化劑NAC預(yù)處理1h后高糖+NAC組MV含量明顯低于高糖組（P＜0.01），高脂+NAC組MV含量也明顯低于高脂組(P＜0.01); ERK抑制劑U0126預(yù)處理1h后高糖+U0126組MV含量與高糖組無(wú)明顯變化(P＞0.05)，高脂+U0126組MV含量與高脂組也無(wú)明顯變化(P＞0.05)。②Western Blot結(jié)果顯示:與對(duì)照

4、組相比，隨高糖刺激時(shí)間延長(zhǎng)ERK、p38蛋白磷酸化水平均明顯升高(P＜0.01)。其中，p38蛋白的磷酸化，在4h作用最強(qiáng)。與對(duì)照組相比，高脂刺激4h后ERK蛋白磷酸化水平明顯升高(P＜0.01);對(duì)于p38蛋白的磷酸化，高脂刺激2h、4h后均有增加(P＜0.01)。其中，對(duì)于ERK蛋白的磷酸化，在4h作用最強(qiáng);對(duì)p38蛋白的磷酸化，則在2h作用最強(qiáng)，而后隨時(shí)間延長(zhǎng)4h（P＜0.01）、6h（P＞0.05）逐漸減少。③流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞

5、凋亡率:與對(duì)照組相比，30mM葡萄糖與25μg/mL ox-LDL處理20小時(shí)后，細(xì)胞凋亡率明顯增高(P＜0.01)。④流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS結(jié)果:30mM葡萄糖刺激THP-1細(xì)胞2h后，ROS的產(chǎn)生達(dá)高峰，達(dá)對(duì)照組的約3倍，而后隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐步遞減趨勢(shì)，至24h均高于對(duì)照組（P＜0.01），在48h回落至基線水平。25μg/ml ox-LDL刺激THP-1細(xì)胞2h，ROS的產(chǎn)生達(dá)到高峰，約為對(duì)照組7倍，而后隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐步遞減