空腸彎曲菌PEB1重組蛋白的免疫原性研究.pdf

1、目的：探討空腸彎曲菌PEB1重組蛋白的免疫原性及對(duì)機(jī)體的保護(hù)性，為空腸彎曲菌PEB1基因工程亞單位疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)。 方法： (1)重組蛋白的表達(dá)、純化及鑒定：培養(yǎng)表達(dá)菌株E．coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體并超聲破碎，用鎳瓊脂糖凝膠層析柱純化重組蛋白，透析后用聚乙二醇濃縮重組蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量后分裝備用，SDS-PAGE電泳鑒定。 (2)PEB1重組蛋白免疫原性研究：

2、以含完全弗氏佐劑的純化PEB1重組蛋白為疫苗，經(jīng)皮下、腹腔及腹股溝淋巴結(jié)多點(diǎn)注射免疫新西蘭兔，分別于第2W、4W、6W用等劑量的PEB1重組蛋白(含不完全弗氏佐劑)加強(qiáng)免疫，并隔周耳緣靜脈采血測(cè)定抗體效價(jià)。10W后無(wú)菌心臟采血，分離血清，飽和硫酸銨沉淀法粗提后SDS．PAGE電泳和Western blot法鑒定抗體，間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。 (3)PEB1重組蛋白免疫效應(yīng)研究：以不同劑量的PEB1重組蛋白疫苗，分別經(jīng)皮下注

3、射和肌肉注射的方法免疫Balb/C小鼠，雙向瓊脂擴(kuò)散法和ELISA法測(cè)定血清中特異性抗體的含量，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖效應(yīng)。 (4)空腸彎曲菌攻擊實(shí)驗(yàn)：加強(qiáng)免疫后第26天用新鮮培養(yǎng)的CJ菌液灌胃攻擊免疫后小鼠，觀查攻擊后一周內(nèi)精神狀態(tài)、死亡情況，并做血液、腸道分泌液細(xì)菌培養(yǎng)，一周后處死小鼠，取小腸做組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果： (1)SDS-PAGE電泳證實(shí)獲得了高純度的純化PEB1蛋白。 (2)用PEB1基因

4、工程疫苗免疫新西蘭兔，誘導(dǎo)出高滴度的特異性抗體，在免疫后4W達(dá)到高峰，6～10W穩(wěn)定在高水平，Western blot結(jié)果證明PEB1重組蛋白能與抗CJ多克隆抗體特異性結(jié)合。 (3)用PEB1重組蛋白免疫Balb/C小鼠，雙向瓊脂擴(kuò)散法和ELISA法也證實(shí)了可誘導(dǎo)出高滴度的特異性抗體，皮下注射100μg組抗體水平最高。 (4)細(xì)胞免疫效應(yīng)研究結(jié)果表明PEB1基因工程疫苗能有效的刺激淋巴細(xì)胞增殖，刺激效果與PHA相當(dāng)，加入

5、刺激原的各實(shí)驗(yàn)組SI值均較對(duì)照組顯著增高(P<0.05)。 (5)細(xì)菌攻擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEB1基因工程亞單位疫苗能使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)力，明顯降低動(dòng)物的患病率和死亡率，各免疫組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)，以1010μg組保護(hù)性最好。 (6)攻擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEB1基因工程疫苗接種能有效降低血液和腸道分泌液的細(xì)菌含量。 結(jié)論： (1)PEB1重組蛋白免疫接種后可誘導(dǎo)出高滴度特異性抗體和