肝細胞生長因子質(zhì)粒DNA在肝組織工程中的應(yīng)用研究.pdf

1、目前因肝臟疾病而引起的人類死亡正在逐年增多，作為肝移植替代療法的肝組織工程研究已成為當前令人矚目的再生醫(yī)學的研究熱點。肝組織工程支架作為肝組織工程三大基本要素(即肝種子細胞、生長因子和肝組織工程支架)之一，其不僅能為肝組織再生提供必需的三維空間，而且作為各種調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移及功能表達等生物活性因子的載體，成為仿生構(gòu)建肝細胞外微環(huán)境的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。鑒于生長因子等生物活性蛋白半衰期短且其在與材料的復(fù)合過程中易失活等原因，近年利用基因工程的

2、方法，在支架上復(fù)合生長因子的基因，通過基因轉(zhuǎn)染使細胞高水平表達其蛋白并作用于細胞的研究受到了組織工程研究者們的青睞。
　　 本文旨在構(gòu)建可表達HGF和紅色熒光蛋白(RFP)融合蛋白基因質(zhì)粒，并利用非病毒基因載體聚乙烯亞胺(PEI)探索其在肝細胞共培養(yǎng)及HGF基因裝載肝組織工程支架誘導(dǎo)肝細胞再組織化研究中的應(yīng)用。
　　 本研究首先以pMD19－T-HGF為模板PCR擴增HGF基因全長序列，定向插入pDsRed-expres

3、s-N1質(zhì)粒，完成HGF和紅色熒光蛋白(RFP)融合蛋白基因質(zhì)粒的構(gòu)建。其經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列測定及293T細胞基因轉(zhuǎn)染實驗均表明，本實驗成功構(gòu)建了可用于真核細胞轉(zhuǎn)染并表達的HGF－紅色熒光融合蛋白基因質(zhì)粒，并優(yōu)化了其真核細胞基因轉(zhuǎn)染條件。
　　 本研究中以PEI為基因轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細胞(3T3)，并分別做了其與原代肝細胞的二維、三維共培養(yǎng)研究，結(jié)果表明共培養(yǎng)中3T3表達的外源HGF蛋白顯著改善了肝細胞的尿

4、素合成功能，同時也表明共培養(yǎng)中外源HGF蛋白的表達及肝細胞與異源非實質(zhì)細胞的接觸可進一步促進肝細胞聚集體的形成及其肝功能的表達。
　　 本實驗進一步研究了聚陰離子(海藻酸)和聚陽離子(殼聚糖)支架組成對界面修飾法裝載HGF基因及其控釋等行為的影響，125I標記基因?qū)嶒灡砻髦Ъ苤芯坳庪x子組分依賴靜電作用力有利于DNA/PEI復(fù)合物的固定及控釋，結(jié)合細胞實驗進一步優(yōu)化了多糖支架的DNA裝載條件，結(jié)果表明聚陰離子載HGF-RFP基因支