MyD88在特定細胞型中對肥胖相關(guān)炎癥疾病的作用.pdf

1、實驗背景:低濃度的全身性炎癥反應(yīng)在肥胖相關(guān)炎癥疾病如胰島素抵抗及主動脈粥樣硬化病變發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，并且與代謝綜合征的發(fā)生呈相關(guān)性。高脂肪飲食(HFD)能影響腸道通透性，引發(fā)全身性炎癥刺激因子的聚集，這些刺激因子包括了白介素-1受體(IL-1R)/toll樣受體(TLRs)的內(nèi)源性與外源性配基。并且已有既往研究證實了IL-1R/TLRs信號通路在高脂飲食致全身性炎癥反應(yīng)及肥胖致炎癥疾病發(fā)展中均起著關(guān)鍵作用。
　　實驗目的:本研

2、究中，我們旨在探索TLR-MyD88（髓樣分化因子88，myeloiddifferentiation factor88，IL-1 R/TLRs主要銜接分子）信號通路是如何在不同細胞類型中協(xié)調(diào)性地參與HFD誘導的全身性炎癥反應(yīng)及代謝性炎癥疾病的起始階段。
　　實驗方法:我們應(yīng)用Cre-LoxP基因敲除技術(shù)得到內(nèi)皮細胞特異性MyD88基因敲除小鼠(MyD88EC-KO)及骨髓/巨噬細胞特異性MyD88基因敲除小鼠(MyD88MC-KO

3、).我們又將MyD88EC-KO小鼠與MyD88MC-KO小鼠與載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)雜交得到MyD88EC-KO ApoE-/-小鼠和MyD88MC-KO ApoE-/-小鼠.這些小鼠被給予正常飲食或高脂飲食（HFD，從小鼠6周大開始）三個月以建立飲食致肥胖模型及主動脈粥樣硬化疾病模型。我們對實驗小鼠檢測了包括體重、體脂肪量、血脂水平及血糖/胰島素濃度等代謝指標，同時應(yīng)用葡萄糖/胰島素耐量試驗來評估其對胰島素的敏感性

4、。我們向小鼠腹腔注射胰島素或生理鹽水后收集脂肪組織、肌肉組織及肝臟組織，并用western-blot檢測胰島素對IRS-1-PI3K-AKT信號通路的激活。為了檢測HFD誘導的全身炎癥反應(yīng)，用ELISA檢測血漿內(nèi)促炎癥細胞因子的蛋白水平。通過免疫組化染色觀察實驗小鼠脂肪組織中巨噬細胞的浸潤量，且進一步對基質(zhì)血管成分細胞染色并予以細胞流式分析巨噬細胞亞型。在主動脈粥樣硬化模型中，對實驗小鼠主動脈進行油紅O染色，用photoshop軟件分析

5、圖像并計算各基因組平均病變面積。通過免疫熒光染色結(jié)合共聚焦顯微鏡檢查病灶內(nèi)巨噬細胞-粒細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）與內(nèi)皮細胞表面標記CD31共定位。我們建立脂肪細胞和巨噬細胞共培養(yǎng)的方法并且用游離脂肪酸(FFAs)/細菌脂多糖(LPS)刺激巨噬細胞來證實巨噬細胞及脂肪細胞間的相互作用。另一方面，我們提取氧化低密度脂蛋白(oxided l

6、ow density lipo-ptortein，ox-LDL)刺激后內(nèi)皮細胞的上清液培養(yǎng)單核/巨噬細胞或直接用ox-LDL刺激GM-CSF促分化的巨噬細胞而闡明內(nèi)皮細胞及巨噬細胞間的相互作用。上述實驗中，RT-PCR用來檢測組織/細胞中炎癥基因及M1/M2巨噬細胞亞型標志基因的表達水平，而western-blot用來分析各信號通路的激活程度。
　　實驗結(jié)果:在高脂飲食小鼠模型中，對骨髓細胞來源MyD88基因的特異性敲除(MyD8

7、8MC-KO)能降低全身性炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗及主動脈粥樣硬化的程度，同時也能減少脂肪組織中巨噬細胞(ATM)的浸潤及ATM從M2抗炎癥巨噬細胞亞型向M1促炎癥亞型的轉(zhuǎn)變。在此基礎(chǔ)上，我們進一步證實了巨噬細胞和脂肪細胞間存在相互作用，而脂肪細胞通過巨噬細胞內(nèi)MyD88介導的信號通路誘導其M1相關(guān)基因的表達。另一方面，內(nèi)皮細胞特異性敲除MyD88基因小鼠(MyD88EC-KO)體內(nèi)M1亞型ATM數(shù)量，全身炎癥反應(yīng)及主動脈粥樣硬化程度與對照

8、組小鼠相比也有一定程度的降低，但不及MyD88MC-KO小鼠表型明顯。同時體內(nèi)及體外實驗均表明，內(nèi)皮細胞來源MyD88依賴生成的GM-CSF因能促使脂肪組織及主動脈組織內(nèi)巨噬細胞極化為M1亞型而在肥胖致全身性炎癥反應(yīng)及主動脈粥樣硬化發(fā)展的起始階段扮演著重要角色。
　　實驗結(jié)論:總而言之，這些結(jié)果都證明了MyD88介導的信號途徑在高脂飲食誘導全身性炎癥反應(yīng)及代謝性炎癥疾病發(fā)生發(fā)展的過程中對脂肪細胞、巨噬細胞及內(nèi)皮細胞三者間相互聯(lián)系起