豬TLR7和MyD88基因克隆，組織表達(dá)譜分析及MyD88酵母表達(dá)的研究.pdf

1、天然免疫是機(jī)體防御微生物病原體入侵第一道防線，機(jī)體細(xì)胞通過(guò)表達(dá)不同的模式識(shí)別受體(Patternrecognitionreceptors，PRRs)，來(lái)識(shí)別包括類脂，脂蛋白，蛋白和核酸在內(nèi)的各種病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)，激活機(jī)體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子和趨化因子及干擾素的表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞表面MHCⅡ類分子和共刺激分子從而參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。Toll樣受

2、體(Toll-likereceptors，TLRs)是天然免疫系統(tǒng)中重要的病原模式識(shí)別受體之一，也是典型的Ⅰ類跨膜受體，至今為止，已經(jīng)在小鼠上發(fā)現(xiàn)了13個(gè)TLRs家族成員，人上11個(gè)。TLRs可以識(shí)別包括細(xì)菌，病毒，原生動(dòng)物和真菌在內(nèi)的多種微生物體的病原體相關(guān)分子模式，在機(jī)體天然免疫中發(fā)揮著重要的作用。 Toll樣受體7(Toll-likereceptor7，TLR7)是TLRs家族的重要成員之一，可以通過(guò)識(shí)別病毒的單鏈RNA(

3、ssRNA)誘導(dǎo)機(jī)體表達(dá)干擾素α(IFN-α)和白細(xì)胞介素12(IL-12)等細(xì)胞因子,對(duì)病毒做出相應(yīng)的免疫應(yīng)答?，F(xiàn)已證實(shí)TLR7可介導(dǎo)多種病毒的免疫應(yīng)答，包括HIV-1，流感病毒，VSV(泡狀口腔炎病毒)和HCV(丙型肝炎病毒)等。髓樣分化因子88(Myeloiddifferentiationprimaryresponseprotein88，MyD88)是TLRs和IL-1Rs信號(hào)傳導(dǎo)途徑中重要的接頭蛋白。近來(lái)研究證實(shí)MyD88還參與

4、了IFN-γ誘導(dǎo)細(xì)胞響應(yīng)，并且對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的mRNA的穩(wěn)定性有著重要的作用。 本研究應(yīng)用RT-PCR、簡(jiǎn)并PCR、RACE、巢式PCR技術(shù)從豬腸系膜淋巴結(jié)組織總RNA中克隆出豬TLR7的cDNA序列。分析結(jié)果表明，克隆到的序列全長(zhǎng)3834bp(GenBank收錄號(hào)：EF469730)，其3153bp的開(kāi)放閱讀框編碼1050個(gè)氨基酸殘基的豬Toll樣受體7蛋白。推導(dǎo)的氨基酸序列分析顯示，在豬TLR7的胞外區(qū)，具有多LRR-RI

5、結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)具有TIR結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)出典型的TLRs家族結(jié)構(gòu)特征，同源性分析結(jié)果顯示，TLR7在進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性，與牛、狗、馬、人、貓和小鼠的氨基酸序列同源性分別為：90.8％、87.4％、87.2％、84.9％、86.7％和78.2％。采用RealtimePCR技術(shù)對(duì)太湖豬TLR7基因在心、腦、肺、肝、脾、腎、骨骼肌、脂肪、腸系膜淋巴結(jié)、空腸和派伊氏結(jié)11個(gè)組織中的表達(dá)譜進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，豬TLR7主要表達(dá)于腸系膜淋巴結(jié)

6、和派伊氏結(jié)等組織。在皮下脂肪、心和骨骼肌組織中表達(dá)量相對(duì)較少。 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從豬腸系膜淋巴結(jié)組織總RNA中克隆出豬MyD88的cDNA序列，我們從三個(gè)不同成年太湖母豬的腸系膜淋巴結(jié)組織克隆該序列來(lái)驗(yàn)證這個(gè)序列。序列分析顯示克隆到的豬MyD88cDNA序列長(zhǎng)897bp，包含豬MyD88基因全CDS區(qū)。該核酸序列已提交到GenBank(GenBank收錄號(hào)：EF198416)。豬MyD88基因開(kāi)放式閱讀框編碼293個(gè)氨基酸殘

7、基的蛋白質(zhì)序列。我們利用在線軟件SMART程序?qū)ν茖?dǎo)的氨基酸序列分析其功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，該蛋白具有典型的MyD88結(jié)構(gòu)，N端具有死亡結(jié)構(gòu)域，中間的連接結(jié)構(gòu)域和C末端的TIR結(jié)構(gòu)域。同源分析表明，豬MyD88蛋白氨基酸序列也具有高度的保守性，與人、牛、小鼠和大鼠的同源性分別為88.4％、85.7％、78.8％和78.2％。豬MyD88與牛和人的遺傳距離較近，與小鼠相對(duì)較遠(yuǎn)，進(jìn)化樹(shù)表明豬先與人和牛聚為一類，然后再與小鼠和大鼠聚類，遺傳距

8、離分析也顯示了相似的結(jié)果。利用RealtimePCR技術(shù)對(duì)太湖豬11個(gè)組織的表達(dá)譜分析顯示豬MyD88基因廣泛表達(dá)于各組織中，在派伊氏結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)組織中表達(dá)量較大，在心臟和骨骼肌組織中表達(dá)量相對(duì)較少。 Pichiapastoris是目前應(yīng)用最廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一.該表達(dá)系統(tǒng)兼有原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：①與釀酒酵母相似，操作簡(jiǎn)單；②不論胞內(nèi)表達(dá)還是分泌表達(dá)，表達(dá)量高;③能對(duì)外源真核基因進(jìn)行正確翻譯和翻譯后加工與

9、修飾，包括蛋白質(zhì)的糖基化，二硫鍵的形成以及蛋白的水解；④表達(dá)試劑盒商業(yè)化。本實(shí)驗(yàn)我們選用pPIC9K作為表達(dá)載體，KM71為宿主菌，在豬MyD88序列兩端分別加上EcoRⅠ和NotⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，終止密碼子前加上六個(gè)組氨酸標(biāo)簽，將序列克隆到T載體，提質(zhì)粒雙酶切后利用T4DNA連接酶克隆到pPIC9K上，利用SacⅠ酶切成單鏈后電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入酵母KM71中，利用組氨酸缺陷型MD平板和含不同濃度G418的YPD平板進(jìn)行篩選，得到了不同抗G4-1