鯉魚(yú)MyD88基因的分子克隆及功能的初步研究.pdf

1、天然免疫是機(jī)體防御微生物病原體入侵第一道防線，機(jī)體細(xì)胞通過(guò)表達(dá)不同的模式識(shí)別受體(PRRs)，來(lái)識(shí)別包括類脂，脂蛋白，蛋白和核酸在內(nèi)的各種病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，激活機(jī)體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子和趨化因子及干擾素的表達(dá)。Toll樣受體(TLRs)家族是參與識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)的模式識(shí)別受體(PRRs)之一，在天然免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用，并且能夠激活適應(yīng)性免疫，是聯(lián)系天然免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。髓樣分

2、化因子88(MyD88)是白介素Ⅰ受體/Toll樣受體超家族胞內(nèi)信號(hào)通路中重要的接頭分子，介導(dǎo)除 TLR3外的TLRs信號(hào)通路。血清淀粉樣 A(Serum amyloid A，SAA)是TLR信號(hào)通路所誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的效應(yīng)分子，是一種主要的急性期蛋白。炎性刺激誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，細(xì)胞因子促進(jìn) SAA高度表達(dá)。
　　本研究以鯉魚(yú)為研究對(duì)象，采用分子克隆和SMART RACE技術(shù)獲得鯉魚(yú)MyD88 cDNA全長(zhǎng)。根據(jù)已得到的cDNA序列

3、，設(shè)計(jì)跨 ORF引物，以DNA為模板，獲得 MyD88基因全長(zhǎng)。MyD88 cDNA序列全長(zhǎng)1728bp，包含3'非翻譯區(qū)870bp，858bp的開(kāi)放閱讀框。MyD88基因全長(zhǎng)3748bp，包含5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子。
　　用生物信息學(xué)方法對(duì)該序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析，MyD88基因序列的分析表明，鯉魚(yú) MyD88基因編碼的蛋白質(zhì)由284個(gè)氨基酸組成，其分子量為32.86kDa、pI為5.79。利用在線軟件 SMART程序?qū)ν茖?dǎo)的氨

4、基酸序列分析其功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，該蛋白具有典型的MyD88結(jié)構(gòu)，N端具有死亡結(jié)構(gòu)域，中間的連接結(jié)構(gòu)域和C末端的TIR結(jié)構(gòu)域。同源分析表明，鯉魚(yú) MyD88蛋白氨基酸序列也具有高度的保守性，其中TIR區(qū)相似性比 ORF和Death區(qū)都高，這與 TIR區(qū)的高度保守性有關(guān)。氨基酸結(jié)構(gòu)分析、多序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析都表明，MyD88與其他物種 MyD88之間有較高的氨基酸相似性，與斑馬魚(yú) MyD88(NM_212814)、牙鲆 MyD88(A

5、B241074)、人 MyD88(NM002468)、小鼠 MyD88(AAC53013)的相似性分別是86.0％、66.9％、60.4％以及59.6％。
　　對(duì)RNA進(jìn)行定量分析后，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA第一鏈，進(jìn)行半定量 RT-PCR，檢測(cè)鯉魚(yú) MyD88在不同組織中的表達(dá)量，結(jié)果顯示MyD88基因在健康鯉魚(yú)的所選組織中均有所表達(dá)，其中在前腸、脾臟、頭腎、口腔上皮和性腺中表達(dá)量較高，后腸和肌肉組織中表達(dá)量