ST2825抑制MyD88蛋白表達(dá)對人肝癌細(xì)胞及裸鼠移植瘤生長的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：原發(fā)性肝癌是全世界范圍內(nèi)極其常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在腫瘤發(fā)病率排行中位列第五，其腫瘤相關(guān)死亡因素在惡性腫瘤中位列第三，且其發(fā)病率仍然呈不斷上升的趨勢。全球每年新發(fā)肝癌患者超過150萬人，其中我國大約占到其中的一半。近年來肝癌的治療方法已經(jīng)發(fā)展為手術(shù)治療為主，射頻消融、介入治療、化療、放療、基因靶向治療為輔的綜合性治療方案，在一定程度上提高了肝癌治愈率。但肝癌在我國依然是僅次于肺癌的第二大腫瘤致死因素。其主要原因是肝癌起病隱匿，在

2、確診時(shí)大多數(shù)已經(jīng)發(fā)展為中晚期，失去了最佳手術(shù)治療機(jī)會。此外，肝癌的高度異質(zhì)性導(dǎo)致其對常規(guī)放、化療方案不敏感，以致肝癌術(shù)后極易復(fù)發(fā)。為了改善肝癌患者預(yù)后，提高疾病治愈率，臨床上亟需尋找一個高效、穩(wěn)定、副作用小的肝癌藥物干預(yù)靶點(diǎn)。
　　NF-κB是人體內(nèi)關(guān)鍵的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在大多數(shù)情況下 NF-κB與它的抑制因子IκB在胞質(zhì)中結(jié)合處于無活性的狀態(tài)。只有在其受到諸如射線、化學(xué)藥品、病毒細(xì)菌、上游刺激因子等激活劑激活后才會與IκB相解

3、離，暴露出結(jié)合橋，并穿過核膜進(jìn)入核內(nèi)指導(dǎo)細(xì)胞周期及DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等環(huán)節(jié)，從而控制細(xì)胞的增殖與凋亡。NF-κB在人體多數(shù)細(xì)胞中極少表達(dá)，且與抑制因子IκB結(jié)合后處于無活性狀態(tài)。現(xiàn)有研究表明腫瘤細(xì)胞中NF-κB表達(dá)量較正常細(xì)胞高出數(shù)倍，這一點(diǎn)已經(jīng)在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等不同腫瘤中得到驗(yàn)證。在肝癌的研究中也得到了類似的結(jié)論，即在肝癌誘導(dǎo)的早期階段，隨著腫瘤的增殖進(jìn)展，NF-κB表達(dá)量呈線性上升趨勢，在肝細(xì)胞徹底癌變時(shí)達(dá)到

4、高峰，之后一直處于高表達(dá)狀態(tài)。許多實(shí)驗(yàn)表明人為地藥物干預(yù)使腫瘤細(xì)胞中的NF-κB失活，可以大幅度地降低相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的含量，并且使腫瘤生長處于停滯狀態(tài)，抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　Toll樣受體4信號通路是目前腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究的焦點(diǎn)之一。近些年，越來越多的觀點(diǎn)認(rèn)為其不僅僅是識別傳遞細(xì)胞內(nèi)信號的中介，而是參與了炎癥發(fā)展、氧自由基產(chǎn)生及免疫誘導(dǎo)功能的重要信號通路，在惡性腫瘤的免疫逃逸機(jī)制中具有關(guān)鍵性的作用。MyD88處于 TLR4信號通路

5、中的公共狹窄部分，起到了銜接上下游信號的關(guān)鍵作用。MyD88的化學(xué)本質(zhì)是一種可溶性蛋白質(zhì)，在TLR4信號通路中起開關(guān)作用。在TLR4通路中，上游Toll樣受體與MyD88的Toll樣區(qū)相結(jié)合，使MyD88激活，并在白細(xì)胞介素1受體的輔助下啟動下游信號的傳導(dǎo)，促使IκB磷酸化并從NF-κB-IκB結(jié)合體中解離下來。最終導(dǎo)致NF-κB的異常激活，暴露出結(jié)合橋并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)啟動原癌基因的異常表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生。
　　ST2825是My

6、d88的特異性抑制劑。實(shí)驗(yàn)證實(shí)ST2825能通過競爭性占據(jù)MyD88的Toll樣受體結(jié)合區(qū)從而抑制上游信號的傳導(dǎo)及白介素1相關(guān)蛋白激酶的活性，進(jìn)而沉默NF-κB的異常表達(dá)。ST2825不易被人體酶解系統(tǒng)所清除，從而具有天然存在的MyD88抑制劑所不具備的優(yōu)點(diǎn)。在抑制MyD88活性方面具有高效、穩(wěn)定等特點(diǎn)。在許多惡性腫瘤及炎癥刺激、免疫誘導(dǎo)等方面已經(jīng)被作為新的藥物靶點(diǎn)來研究，取得了重要突破。但其在肝癌的預(yù)防及治療研究中還未見詳實(shí)的報(bào)道?；?/p>

7、于以上理論，我們有理由建立這樣的假設(shè)：ST2825能夠干預(yù)人肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制肝癌常規(guī)發(fā)展進(jìn)程，提高肝癌患者生存率。本課題從在體與離體兩個角度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以期發(fā)現(xiàn)新的高效干預(yù)肝癌進(jìn)展的藥物作用靶點(diǎn)。
　　目的：
　　1.明確Myd88在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。
　　2.明確應(yīng)用ST2825后肝癌細(xì)胞的增殖凋亡情況及裸鼠移植瘤的生長情況。
　　方法：
　　1.以免疫組化、RT-PCR法檢測肝

8、癌及其癌旁組織標(biāo)本中MyD88基因的表達(dá)情況并分析MyD88在肝癌組織中的表達(dá)是否顯著高于癌旁組織。
　　2.RT-PCR及Western blot法探討不同濃度ST2825作用下人肝癌細(xì)胞MyD88基因的表達(dá)變化情況。
　　3.流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)、MTT法及Western blot法檢測ST2825作用后人肝癌細(xì)胞的增殖及凋亡變化情況。
　　4.在體檢測ST2825作用后對人肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的抑制情況。
　　

9、結(jié)果：
　　1.免疫組化法結(jié)果顯示MyD88基因在肝癌中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，RT-PCR結(jié)果顯示MyD88 mRNA在肝癌中的表達(dá)顯著高于癌旁組織。
　　2.RT-PCR及Western blot法結(jié)果顯示在不同濃度ST2825作用后人肝癌細(xì)胞MyD88基因的表達(dá)有不同程度的降低，且ST2825濃度越高，MyD88表達(dá)越低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，應(yīng)用 ST2825后人肝癌細(xì)胞早期凋亡比

10、例明顯增高，且GO/G1期細(xì)胞比例明顯升高。
　　4.應(yīng)用ST2825后人肝癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低。增殖相關(guān)蛋白cyclin D1、P65表達(dá)顯著降低，I?B表達(dá)顯著升高。
　　5.MTT法檢測結(jié)果顯示應(yīng)用ST2825后人肝癌細(xì)胞活性呈劑量依賴性顯著降低。
　　6.在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示應(yīng)用ST2825可抑制裸鼠移植瘤的生長。
　　結(jié)論：
　　1.My