沉默ABCG2基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞GLC-82體內(nèi)增殖及細(xì)胞形態(tài)的影響.pdf

1、研究背景和目的： 肺癌是近年來發(fā)病率和死亡率呈不斷上升趨勢的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究表明，肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段與多基因變異積累的復(fù)雜的病理演變過程。雖然隨著對腫瘤性疾病的深入研究，肺癌的治療方法和策略較以前已有很大進(jìn)步，但是患者的5年生存率仍低于15%。因此深入研究肺癌的發(fā)病機(jī)制，是防治肺癌的迫切需要。 為進(jìn)一步確定ABCG2在肺癌細(xì)胞增殖中的作用，本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)（

2、RNAi）在建立ABCG2基因沉默之人肺腺癌細(xì)胞GLC-82動物皮下腫瘤模型的基礎(chǔ)上，對ABCG2基因沉默對人肺腺癌細(xì)胞GLC-82體內(nèi)增殖的影響進(jìn)行研究；用形態(tài)定量、體視學(xué)方法定量分析沉默ABCG2基因后肺癌細(xì)胞體內(nèi)外的形態(tài)變化及超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為進(jìn)一步探討ABCG2對肺癌細(xì)胞生物學(xué)的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為肺癌的防治提供方法和策略。 方法： 一、沉默ABCG2基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞GLC-82體內(nèi)增殖能力的影響。 1．

3、將本實(shí)驗(yàn)室保存的人肺腺癌細(xì)胞GLC-82、已建系并鑒定的綠色增強(qiáng)熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的細(xì)胞GLC-82/EGFP+及ABCG2基因沉默的細(xì)胞GLC-82/EGFP+/ABCG2-分別接種于裸鼠皮下，觀察細(xì)胞成瘤能力的變化，繪制體內(nèi)生長曲線。 2．流式細(xì)胞術(shù)檢測瘤組織中瘤細(xì)胞的周期分布。 3．應(yīng)用免疫組化（SP法）觀察裸鼠皮下瘤組織中Ki-67、ABCG2、Bcl-2、p53的表達(dá)，并用圖像分析系統(tǒng)對ABCG2蛋白在瘤

4、細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行定量分析，測試其表達(dá)的陽性單位。 4．采用Ploton法對瘤組織進(jìn)行核仁組成區(qū)嗜銀蛋白（AgNORs）染色，用圖像分析系統(tǒng)測試平面上腫瘤細(xì)胞核內(nèi)AgNORs顆粒數(shù)、單個(gè)AgNORs顆粒面積、單個(gè)核AgNORs總面積，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方案對AgNORs進(jìn)行形態(tài)學(xué)分型。 二、沉默ABCG2基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞GLC-82細(xì)胞形態(tài)的影響。 1．觀察GLC-82/EGFP+/ABCG2-、GLC-82/EGFP

5、+、GLC-82細(xì)胞體內(nèi)體外形態(tài)，體外細(xì)胞培養(yǎng)爬片后行HE染色和細(xì)胞骨架蛋白染色。 2．用圖像分析系統(tǒng)測試沉默ABCG2基因后GLC-82細(xì)胞爬片及瘤組織切片下細(xì)胞的幾何形態(tài)學(xué)參數(shù)。選取的形態(tài)學(xué)參數(shù)包括細(xì)胞與核的面積（Ac，An）、細(xì)胞與核的周長（Cc，Cn）、細(xì)胞與核的長軸（dmaj，c，dmaj，n）、細(xì)胞與核的短軸（dmin，c，dmin，n）、軸比（Rac，Ran）、胞漿面積（Acp）、核漿比（Rnp）、細(xì)胞與核的形狀因

6、子PE（PEc，PEn）、細(xì)胞與核的形狀因子AR（ARc，ARn）、細(xì)胞與核的規(guī)劃形狀因子RFF（RFFc，RFFn）以及細(xì)胞與核形狀不規(guī)則指數(shù)FII（FIIc，F(xiàn)IIn）。 3．裸鼠皮下瘤組織常規(guī)電鏡制樣、半薄切片定位后行超薄切片，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對瘤細(xì)胞的細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行體視學(xué)定量分析。選用的體視學(xué)參數(shù)有體積密度（Vv）、表面積密度（Sv）、數(shù)密度（Nv）、平均體積（v）、平均表面積（s）、平均自由程（λ）、表面積

7、與體積比（Rsv），此外還有核漿比（Rnp）。 結(jié)果： 一、沉默ABCG2基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞GLC-82體內(nèi)增殖能力的影響。 1．GLC-82/EGFP+/ABCG2-細(xì)胞與GLC-82/EGFP+、GLC-82細(xì)胞相比，裸鼠皮下成瘤能力降低，表現(xiàn)為GLC-82/EGFP+/ABCG2-細(xì)胞生長滯后且其成瘤組織的體積均小于GLC-82/EGFP+和GLC-82，差異有顯著性（P<0．001）。 2．流式細(xì)

8、胞術(shù)檢測瘤組織中瘤細(xì)胞的周期發(fā)現(xiàn)：GLC-82/EGFP+/ABCG2-、GLC-82/EGFP+、GLC-82細(xì)胞的S期細(xì)胞比例兩兩比較無顯著性差異（P=0．556），ABCG2基因沉默后，細(xì)胞周期中S期的比例明顯減少，而G1期細(xì)胞比例明顯增多，差異具有顯著性（P<0．001）。 3．免疫組化檢測：裸鼠體內(nèi)GLC-82/EGFP+/ABCG2-細(xì)胞成瘤組織中ABCG2蛋白的表達(dá)明顯減弱，其陽性單位小于GLC-82、GLC-82

9、/EGFP+細(xì)胞成瘤組織，差異具有顯著性（P<0．001）。Ki-67增殖指數(shù)（PI）在GLC-82/EGFP+/ABCG2-細(xì)胞成瘤組織中的表達(dá)較GLC-82組、GLC-82/EGFP+組明顯降低（P<0．001）；Bcl-2在3組細(xì)胞的成瘤組織中均不表達(dá)，p53在3組中均有少量表達(dá)，但差異無顯著性意義。 4．AgNORs圖像分析結(jié)果顯示，GLC-82/EGFP+/ABCG2-細(xì)胞中AgNORs的顆粒數(shù)、單個(gè)核內(nèi)AgNORs總

10、面積減少，而單個(gè)AgNORs顆粒面積增大，差異具有顯著性（P<0．001）。對AgNORs的形態(tài)分型結(jié)果表明，GLC-82/EGFP+/ABCG2-組瘤組織細(xì)胞中AgNORs顆粒主要為混合型，而GLC-82/EGFP+組、GLC-82組AgNORs顆粒主要為彌散型，差異具有顯著性（P<0．001）。 二、沉默ABCG2基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞GLC-82細(xì)胞形態(tài)的影響。 1．GLC-82/EGFP+/ABCG2-細(xì)胞體外培養(yǎng)呈

11、梭形，GLC-82/EGFP+細(xì)胞、GLC-82細(xì)胞呈圓形、橢圓形或多角形。 2．細(xì)胞骨架蛋白染色結(jié)果顯示：GLC-82/EGFP+/ABCG2-細(xì)胞中細(xì)胞骨架纖細(xì)，延伸于整個(gè)胞漿，GLC-82/EGFP+細(xì)胞、GLC-82細(xì)胞較粗，濃集于細(xì)胞核周圍。 3．圖像定量分析HE爬片的細(xì)胞平面形態(tài)學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)GLC-82/EGFP+/ABCG2-細(xì)胞與GLC-82/EGFP+細(xì)胞、GLC-82細(xì)胞相比，dmaj，c、Cc、Rac

12、、dmaj，n、Ran、Ac、Acp、FIIc、FIIn增大，PEc、ARc、RFFc、PEn、ARn、RFFn、Rnp減小，差異具有顯著性（P<0．001）。 4．瘤組織HE切片鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，GLC-82/EGFP+/ABCG2-組細(xì)胞胞體增大、胞漿空亮，AB-PAS染色呈陰性，證明空亮的胞漿中所含物質(zhì)非粘液；此外細(xì)胞核大小懸殊，核形不規(guī)則。 5．圖像定量分析顯示GLC-82/EGFP+/ABCG2-組細(xì)胞與GLC-8

13、2/EGFP+組、GLC-82組相比，F(xiàn)IIn、Ac、Acp增大，PEn、ARn、RFFn、Rnp減小，差異具有顯著性（P<0．001）。 6．電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核異型性明顯，胞漿內(nèi)可見線粒體及大量溶酶體，GLC-82/EGFP+/ABCG2-組細(xì)胞內(nèi)的線粒體空泡化明顯，較多擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并可見胞漿內(nèi)特征性的“蛋白池”（由蛋白樣分泌物形成的“池”狀結(jié)構(gòu)）。 7．對瘤細(xì)胞的細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的體視

14、學(xué)定量分析，結(jié)果顯示GLC-82/EGFP+/ABCG2-組細(xì)胞核的Vv、Sv、Rnp小于GLC-82/EGFP+組，λ大于GLC-82/EGFP+組，差異具有顯著性（P<0．001）；GLC-82/EGFP+/ABCG2-組細(xì)胞線粒體的Vv、Sv大于GLC-82/EGFP+組，λ小于GLC-82/EGFP+組，差異具有顯著性（P<0．001）；GLC-82/EGFP+/ABCG2-組細(xì)胞線粒體的Nv、v、s雖然大于GLC-82/EGF

15、P+組，但差異尚未顯示出顯著性（P>0．05）。GLC-82/EGFP+/ABCG2-組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的V，大于GLC-82/EGFP+組，Rsv小于GLC-82/EGFP+組，差異具有顯著性（P<0．001）。 結(jié)論： 1．沉默ABCG2基因能使GLC-82細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤能力明顯降低，表明ABCG2基因?qū)LC-82細(xì)胞的體內(nèi)增殖具有重要作用，可作為人肺腺癌細(xì)胞的治療靶點(diǎn)加以研究； 2．GLC-82/EGFP+/A

16、BCG2-組成瘤組織癌細(xì)胞Ki-67增殖指數(shù)下降；瘤組織癌細(xì)胞大部分被抑制在G1期：AgNORs的顆粒數(shù)及單個(gè)核內(nèi)AgNORs總面積減少，而單個(gè)AgNORs顆粒面積增大，且AgNORs主要為混合型，而沉默對照組（GLC-82/EGFP+組）和空白對照組（GLC-82組）AgNORs主要為彌散型。 3．沉默ABCG2基因后的GLC-82/EGFP+/ABCG2-細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變：體外培養(yǎng)細(xì)胞呈梭形；瘤細(xì)胞在體內(nèi)表現(xiàn)為細(xì)胞體積增