HO-1基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 HO-1基因轉(zhuǎn)染豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及磁粒子標(biāo)記的體外研究
　　 目的將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hHO-1轉(zhuǎn)染豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），并應(yīng)用超順磁性氧化鐵納米粒子（superparamagnetic iron oxide，SPIO）標(biāo)記轉(zhuǎn)染的MSCs，觀察其血紅素氧化酶-1（HO-1）的基因表達(dá)、SPIO的標(biāo)記效率及細(xì)胞的生物學(xué)特性。方法貼壁離心法分離并培養(yǎng)小型豬骨

2、髓源性MSCs，酶切和基因測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hHO-1并轉(zhuǎn)染至MSCs，與SPIO（20μg/ml）共孵育24 h，Western blot檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá)，普魯士藍(lán)染色檢測(cè)顯示細(xì)胞內(nèi)鐵表達(dá)，臺(tái)盼蘭染色檢測(cè)細(xì)胞的活性，四氮噻唑藍(lán)（MTT）試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，Annexin/碘化吡啶（PI）雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 pcDNA3.1-hHO-1轉(zhuǎn)染后MSCs中HO-1表達(dá)增加，SPIO標(biāo)記效率達(dá)100％，SPIO標(biāo)記后

3、對(duì)細(xì)胞的活性、增殖及凋亡無明顯影響。結(jié)論 pcDNA3.1-HO-1能有效轉(zhuǎn)染入豬MSCs，SPIO可以有效標(biāo)記豬骨髓源性MSCs，且對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)特性無明顯影響。
　　 第二部分 HO-1基因修飾的MSCs自體移植治療豬急性心肌梗死的研究
　　 目的觀察HO-1基因修飾的MSCs對(duì)急性心肌梗死的治療作用。方法MSCs分為對(duì)照組（MSCs）、空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（LacZ-MSCs）、pcDNA3.1-hHO-1轉(zhuǎn)染組（H0.

4、1-MSCs），缺氧誘導(dǎo)觀察HO-1轉(zhuǎn)染后MSCs的凋亡及上清液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)。建立小型豬急性心肌梗死模型，分為生理鹽水組，干細(xì)胞治療組（MSCs組）及pcDNA3.1-hHO-1治療組，行自體MSCs移植。治療后3個(gè)月采用3.0 T磁共振行磁粒子示蹤及心功能檢測(cè)。普魯士藍(lán)染色檢測(cè)磁粒子水平，免疫組化檢測(cè)毛細(xì)血管密度（血管數(shù)/HPF）。結(jié)果缺氧誘導(dǎo)后HO-1-MSCs組凋亡率（30.30±7.64）％低于MSCs組（

5、56.93±4.68）％（p<0.001）和LacZ-MSCs組（55.88±4.38）％（p<0.001），HO-1-MSCs組VEGF水平（768.44±78.38）pg/ml高于MSCs組（555.27±67.67）pg/ml（p<0.001）和LacZ-MSCs組（522.97±71.45）Pg/ml（p<0.001）；治療1周后3組心功能無明顯差異，治療3月后HO-1-MSCs組左室射血分?jǐn)?shù)（53.50±2.09）％明顯高于M

6、SCs組（49.54±2.74）％（P=0.017）和生理鹽水組。梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管密度HO-1-MSCs組（14.59±2.39）較MSCs組（11.78±2.48，p=0.033）和生理鹽水組明顯增多。結(jié)論HO-1基因轉(zhuǎn)染的MSCs移植治療明顯改善急性心肌梗死的心功能。
　　 第三部分 HO-1基因修飾的MSCs移植治療對(duì)心肌梗死后血管新生的研究
　　 目的探討HO-1-MSCs移植治療對(duì)心肌梗死后血運(yùn)重建的影響。方

7、法體外培養(yǎng)MSCs，細(xì)胞分為四組，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組（MSCs）、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組（LacZ-MSCs）、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-hHO-1組（HO-1-MSCs），轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-hHO-1組加SnPP干預(yù)組（HO-1-MSCs+SnPP），體外實(shí)驗(yàn)予缺氧誘導(dǎo)后比較各組抗凋亡情況，同時(shí)收集上清液檢測(cè)TGF-β和FGF-2的表達(dá)。建立小型豬急性心肌梗死模型，分為生理鹽水組，LacZ-MSCs，HO-1-MSCs組及HO-1-MSCs+SnP

8、P組，行自體MSCs移植。細(xì)胞移植后1個(gè)月行磁共振檢測(cè)。1個(gè)月后處死動(dòng)物，普魯士藍(lán)染色檢測(cè)磁粒子水平，免疫組化檢測(cè)毛細(xì)血管密度和功能血管密度（血管數(shù)/HPF）。結(jié)果（1）體外缺氧誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中HO-1-MSCs組凋亡比率明顯較其他組下降，同時(shí)上清液中HO-1-MSCs組TGF-β的分泌較LacZ-MSCs組明顯升高（p<0.001），F(xiàn)GF-2的分泌HO-1-MSCs組亦明顯高于Lacz-MSCs組（p<0.001）。（2）細(xì)胞移植4周后H

9、O-1-MSCs組LVEF明顯高于Lacz-MSCs組（p<0.05）。梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管密度（血管數(shù)/HPF）HO-1-MSCs組明顯高于Lacz-MSCs組（p<0.001）。梗死周邊區(qū)功能血管密度HO-1-MSCs組亦明顯高于Lacz-MSCs組（p=0.001）。結(jié)論HO-1基因轉(zhuǎn)染MSCs后較單純MSCs移植更加增強(qiáng)其心肌梗死后血管新生作用。
　　 第四部分 HO-1基因轉(zhuǎn)染同種異體干細(xì)胞后移植治療急性心肌梗死的研究<

10、br>　　 目的探討HO-1基因修飾后的同種異體MSCs移植治療急性心肌梗死的作用。方法體外培養(yǎng)MSCs，細(xì)胞分為MSCs組、LacZ-MSCs組、HO-1-MSCs組，HO-1-MSCs+SnPP組，予缺氧誘導(dǎo)后檢測(cè)上清VEGF、TNF-α和IL-6的水平。建立雌性小型豬急性心肌梗死模型，分為生理鹽水組，LacZ-MSCs組，HO-1-MSCs組及HO-1-MSCs+SnPP組，行雄性源性MSCs移植。細(xì)胞移植后1周及3月行磁共振檢

11、測(cè)。1周和3月時(shí)分別處死部分動(dòng)物，取心臟標(biāo)本行相關(guān)檢查。結(jié)果（1）體外缺氧誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中HO-1-MSCs組VEGF分泌明顯上升以及TNF-α和IL-6分泌的明顯下降（p<0.05）。（2）細(xì)胞移植1周后處死部分實(shí)驗(yàn)豬，普魯士藍(lán)染色陽性但同時(shí)巨噬細(xì)胞染色陽性，HO-1-MSCs組心肌檢測(cè)VEGF明顯增加，TNF-α和IL-6明顯下降，伴隨Bcl-2明顯增加。實(shí)時(shí)定量PCR顯示HO-1-MSCs組移植干細(xì)胞存活明顯增加。心功能顯示HO-1-M

12、SCs組LVEF明顯高于生理鹽水組（p<0.05）。（3）3月時(shí)MRI檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)低信號(hào)區(qū)，普魯士藍(lán)染色陰性。HO-1-MSCs組LVEF明顯高于Lacz-MSCs組（p<0.05）。梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管密度（血管數(shù)/HPF）HO-1-MSCs組明顯高于Lacz-MSCs組（p<0.001）。梗死周邊區(qū)功能血管密度（血管數(shù)/HPF）HO-1-MSCs組亦明顯高于Lacz-MSCs組（p<0.05）。結(jié)論HO-1基因轉(zhuǎn)染MSCs后較單純MSC