快速篩選重組羊口瘡病毒NA1-11△132以及構建表達EV71 VP1蛋白的重組羊口瘡病毒NA1-11-VP1.pdf

1、羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)屬于痘病毒科（Poxviridae）脊椎動物痘病毒亞科（Chordopoxrinae）中的副痘病毒屬（Parapoxvirus），是非整合宿主染色體，在胞漿內復制的有囊膜的雙鏈DNA核酸病毒，其堿基數(shù)可達到134-139kb，GC含量高達64％，中間區(qū)域高度保守，為病毒復制的必須基因，末端為反向重復的堿基序列，為一般致病性、毒力、嗜宿主和組織的功能基因。
　　ORFV宿主范圍窄，主要感染綿

2、羊和山羊，有時也會感染馴鹿、麝香牛，甚至人類。其主要通過接觸破損的皮膚傳播，引起口唇、鼻孔、眼部及乳房周圍皮膚的化膿性感染，偶爾也會引起其他器官如胃、腸、呼吸道的感染，但是具有自限性，不會引起全身性病毒播散，總體致死率非常低。但是妊娠的母羊、年幼或者免疫缺陷的羔羊若患此病，其致死率非常高，可以達到80％以上。傳統(tǒng)的羊口瘡病毒疫苗主要以滅活疫苗或弱毒疫苗為主，但滅活疫苗通常不能有效激活細胞免疫，而弱毒活疫苗則存在非疫區(qū)擴散風險，因此限制了

3、其運用。利用基因工程技術敲除ORFV的相關毒力基因可獲得減毒的活病毒疫苗，成為羊口瘡病毒疫苗研究新熱點。羊口瘡病毒編碼血管內皮生長因子基因(Vascularendothelial growth factor，VEGF)，該基因編碼的VEGF蛋白與哺乳動物表達的VEGF具有高度的同源性，可以與血管內皮生長因子受體2(KDR)結合，調節(jié)血管生成，促進血管內皮細胞增殖，增加血管通透性，引起充血水腫的炎癥反應，是其主要的致病性基因。病毒的VEG

4、F分子可使感染后期易于形成結痂，而較多的結痂有助于病毒長期存活。利用基因工程技術去除該致病性基因得到的ORFV突變體也許能成為新型的減毒活病毒疫苗候選物。另外，ORFV是一種潛在的溶瘤病毒，Rintoul等通過實驗發(fā)現(xiàn)，ORFV不易在正常人體組織復制，但是在腫瘤組織卻有強大的復制功能，并且在肺癌模型上取得了顯著的治療效果。除此之外，國外已有相關文獻報導，羊口瘡病毒VEGF基因的位置非常適合表達外源抗原，并利用減毒的羊口瘡病毒D1701-

5、V為載體成功表達了針對皰疹病毒、兔出血熱疾病病毒、狂犬病病毒、甲型流感病毒H5N1和H1N1的疫苗候選物，其免疫保護作用持久穩(wěn)定，不需要佐劑即能強力誘導Th1-Th2平衡的先天免疫和獲得性免疫反應。短期的ORFV感染不能誘導特異性中和抗體的產生，因此可以使用同一或不同的該病毒重組體反復接種免疫。而且ORFV只在胞漿中復制，不會插入宿主細胞染色體引起基因突變，安全性較高，可能成為未來理想的克隆表達載體。
　　截止目前為止，除了新西蘭

6、株羊口瘡病毒NZ2進行了詳細的全基因遺傳結構功能分析外，美國株IA82，德國株D1701以及中國株NA1/11也進行了基因序列分析比較。中國株NA1/11為中國吉林省一次爆發(fā)的羊痘瘡疾病分離所得，其132基因編碼血管內皮生長因子VEGF。本次實驗中，我們利用同源重組的方法敲除羊口瘡病毒株NA1/11的132基因，通過綠色熒光標記蛋白快速篩選出減毒的重組羊口瘡病毒NA1/11△132，并通過體外實驗，初步證明132基因為羊口瘡病毒NA1/

7、11生長復制的非必需基因，且外源基因GFP的插入并不會影響病毒體外的感染復制特性，但132基因的敲除可以使ORFV減少VEGF的分泌，減輕了病毒的毒力。利用已構建的快速病毒基因敲除方法，我們以手足口病EV71 VP1基因替換了羊口瘡病毒NA1/11的132基因，通過綠色熒光信號成功獲得純化的重組羊口瘡病毒突變株，命名為NA1/11-VP1，以期構建手足口病的疫苗候選物。
　　研究內容包含兩個部分:
　　第一部分:快速篩選重組

8、羊口瘡病毒NA1/11△132
　　綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)最早是由下村修等人于1962年在一種學名Aequoreavictoria的水母中發(fā)現(xiàn)。GFP作為一種報告分子，廣泛運用于細菌、植物甚至人類等研究，在蛋白表達檢測、蛋白和細胞熒光示蹤、蛋白質的結構及功能的研究中具有重要意義。傳統(tǒng)重組病毒的篩選主要通過新霉素抵抗和β-葡萄糖醛酸苷酶(neomycinresistance and

9、β-glucuronidase，neo/gus)藍白斑篩選，該方法不易把握，操作麻煩，且耗時長。為了更簡單，快速篩選出減毒的重組羊口瘡病毒，在本研究中，我們在具有綠色熒光蛋白GFP標簽的pSPV-EGFP質粒上插入了羊口瘡病毒NA1/11的132基因左右同源臂，經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定，命名為pSPV-132L-EGFP-132R。然后將該穿梭質粒通過脂質體法轉染感染了NA1/11的羊胚胎鼻甲骨細胞(Primary ovine feta

10、l turbinate，OFTu)，經(jīng)過2輪96微孔板稀釋和3輪六孔板蝕斑純化實驗后，將篩選出來的病毒擴大培養(yǎng)，36小時后，在倒置熒光顯微鏡下，可以觀察到視野中有大量熒光信號，提取病毒核酸經(jīng)PCR驗證，羊口瘡病毒的132基因已敲除并且檢測到了GFP基因，將缺失132基因的羊口瘡病毒命名為NA1/11△132，并經(jīng)病毒滴定、體外血管內皮細胞增殖實驗以檢測132基因缺失后的功能影響。
　　第二部分:構建表達EV71 VP1蛋白的重組羊

11、口瘡病毒NA1/11-VP1
　　國外相關實驗研究發(fā)現(xiàn)ORFV的VEGF基因位置非常適合插入外源抗原。本次實驗希望以羊口瘡病毒NA1/11為表達載體，通過同源重組的方法構建表達腸道病毒71型VP1蛋白的重組羊口瘡病毒NA1/11-VP1。本實驗首先抽提手足口病EV71的RNA，擴增EV71的VP1全基因，并擴增質粒pCMVTAG4a早期啟動子CMV，按照先后順序插入質粒pSPV-132L-EGFP-132R中構建重組質粒pSPV-

12、EGFP/VP1;轉染OFTu細胞，與羊口瘡病毒NA1/11同源重組，通過熒光信號純化重組羊口瘡病毒NA1/11-VP1，抽提重組羊口瘡病毒核酸，進行PCR、測序驗證EV71 VP1基因的存在以及132基因的缺失，并且經(jīng)過間接免疫熒光以及免疫印跡實驗檢測手足口病EV71 VP1蛋白的表達情況。實驗結果發(fā)現(xiàn)，在羊口瘡病毒NA1/11的VEGF基因位置的GFP蛋白成功表達，可以檢測到綠色熒光信號，但是同樣插在VEGF基因位置上的EV71 V

13、P1基因卻沒有表達，使用EV71 VP1單抗和多抗均無法檢測到VP1蛋白。
　　小結:
　　根據(jù)以上兩個部分的研究，本研究小結如下:
　　1、利用GFP作為報導基因成功篩選出減毒的重組羊口瘡病毒NA1/11△132，其132基因的敲除以及GFP基因的存在已經(jīng)通過PCR和基因測序驗證。
　　2、本次實驗證實以綠色熒光蛋白為報導基因的重組病毒篩選方法具有以下優(yōu)點:直觀:通過熒光信號即可以判斷同源重組效率的高低，為進行

14、下一輪篩選實驗提供參考依據(jù)，比傳統(tǒng)方法更直觀，操作性更強;快速:重組病毒的篩選時間短，蝕斑篩選時間不超過15天，而傳統(tǒng)的蝕斑篩選方法需要3-4個月的時間;廉價:不需要借助貴重儀器即可分離重組病毒。雖然以GFP為報導基因，借助流式細胞分選儀，可以快速分選出重組病毒，但是流式細胞分選儀價格昂貴，而且病毒分選存在污染問題，因此不易推廣使用;科學:利用熒光信號進行蝕斑篩選不需要添加抗生素和反應底物，比傳統(tǒng)方法更科學，更經(jīng)濟。
　　3、通過

15、體外實驗，初步證明132基因為ORFV生長復制的非必需基因，且外源基因GFP的插入并不會影響病毒感染復制特性，但132基因的敲除可以使病毒減少VEGF的分泌，減輕了病毒的毒力。
　　4、羊口瘡病毒的VEGF基因位置適合表達外源抗原蛋白，但是同一基因位點的表達不能采用雙啟動子，不能同時啟動兩種不同的外源蛋白表達，避免其中一個啟動子不工作;
　　5、在同一基因位點同時表達EV71 VP1和GFP蛋白，GFP蛋白的空間構象可能影響