大腸桿菌LTB聯(lián)合EV71亞單位疫苗VP1鼻腔免疫效果評價.pdf

1、手足口病是由腸道病毒感染引起的，可以產生多種并發(fā)癥，嚴重者可致死。引發(fā)手足口病的腸道病毒以柯薩奇病毒A16型(coxsackievirus A16，Cox A16)和腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)最為常見，VP1作為EV71的毒力蛋白具有極其重要的研究價值。VP1蛋白構象發(fā)生變化導致病毒釋放RNA到宿主細胞，同時VP1蛋白也是病毒主要的表達抗原及中和表位。因此，VP1結構蛋白成為了發(fā)展腸道病毒71型亞單位疫苗的候

2、選抗原。
　　耐熱腸毒素(heat-stable enterotoxin，ST)和不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin， LT)是產腸毒素大腸桿菌(Enterotox igenic Escherichia coli，ETEC)分泌的兩種毒性蛋白。LT的B亞單位(Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit,LTB)已被研究證實是有效的粘膜免疫佐劑，與其

3、它抗原聯(lián)合進行粘膜免疫后可刺激機體產生強烈的系統(tǒng)免疫應答和粘膜免疫應答。
　　目的:構建重組產腸毒素大腸桿菌LTB基因的原核表達載體pET32a-LTB，檢測誘導表達的6×His-LTB融合蛋白的免疫原性，并探討EV71型VP1蛋白聯(lián)合純化LTB通過鼻腔粘膜免疫的效果。
　　方法:(1)構建重組質粒pET32a-LTB，轉化Escherichia coliBL21(DE3)，IPTG誘導表達。(2)表達的LTB融合蛋白帶有6

4、個His標簽，可通過His標簽瓊脂鎳柱純化，純化蛋白復性濃縮后經新西蘭大白兔頸背部和后腳掌多點注射進行皮下免疫，抗原每次免疫的劑量為300μg，一共免疫3次，免疫間隔時間為2周，末次免疫7d后，用注射器從兔心臟直接取血，血液自然凝固后離心分離血清，采用間接ELISA法檢測抗血清中IgG抗體效價。(3)分別用生理鹽水、EV71 VP1、LTB聯(lián)合EV71 VP1經鼻腔免疫BALB/c小鼠，一共免疫三次，免疫間隔時間為一周，第三次免疫10d

5、后收集小鼠心臟血清、肺部沖洗液、小腸粘膜沖洗液，用間接ELISA法檢測血清中抗原特異性IgG和粘膜沖洗液中抗原特異性IgA。
　　結果:(1)經過質粒雙酶切鑒定、半定量PCR、質粒測序證實已成功構建重組原核表達質粒pET32a-LTB。(2)6×His-LTB融合蛋白在BL21(DE3)中的主要存在形式為包涵體，表達的目的蛋白相對分子質量（Mr）約為30 kD;300ml菌液純化的LTB蛋白復性濃縮至3ml后濃度為2.12 mg/

6、ml，ELISA檢測其免疫兔所得抗血清IgG效價為1∶125000。(3) EV71 VP1聯(lián)合LTB免疫組的血清特異性IgG，肺部沖洗液和小腸粘膜沖洗液中特異性IgA抗體水平相較于EV71 VP1單獨免疫組和生理鹽水對照組有明顯增高，且差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論:已成功在E.coli BL21(DE3)中表達了6×His-LTB融合蛋白，純化的融合蛋白具有良好的免疫原性和佐劑活性。通過滴鼻免疫，LTB可有效誘導和增強EV71