樹突狀細胞提呈重組口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1-VP4抗原的機制.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouthdisease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(FMDvirus，F(xiàn)MDV)感染偶蹄類動物所引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，目前還沒有安全有效的防控措施。實驗證明，F(xiàn)MDV野毒株并不感染樹突狀細胞（Dendriticcells，DCs），但被中和抗體IgG調(diào)理的FMDV不僅可以感染DCs，導(dǎo)致其抗原提呈功能喪失，而且還造成DCs大量死亡。當(dāng)DCs負(fù)載滅活FMDV免疫復(fù)合物后卻能夠有效地刺激T細胞，并產(chǎn)

2、生很好的免疫保護。因此，人們開始重視機體對FMDV細胞免疫應(yīng)答機制的研究。而啟動細胞免疫應(yīng)答需要DCs的抗原提呈，但目前尚未見此類研究報道。
　　 本研究通過構(gòu)建pET32a-VP1-VP4原核表達體系，表達重組VP1-VP4結(jié)構(gòu)蛋白，并進行FITC標(biāo)記。通過將甘露糖受體(mannosereceptor,MR)抑制劑、清道夫受體（scavengerreceptor,SR）抑制劑、巨吞飲抑制劑、Hsp90抑制劑、蛋白酶體抑制劑、溶

3、酶體酸化和溶酶體酶抑制劑、循環(huán)內(nèi)體轉(zhuǎn)運抑制劑以不同組合處理骨髓源樹突狀細胞(BMDCs)，再用VP1-VP4負(fù)載BMDCs。利用激光共聚焦熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)和ELISA等方法檢測BMDCs對VP1-VP4攝取、加工與呈遞的動力學(xué)過程。
　　 激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在正常組BMDCs，被攝取的VP1-VP4-FITC抗原位于早期內(nèi)吞小體，并且細胞內(nèi)抗原的量隨著攝取時間增加而增加，形成的內(nèi)吞小體逐漸增大。抑制巨吞飲后的BMD

4、Cs內(nèi)含VP1-VP4的內(nèi)吞小體顯著減少，說明巨吞飲是BMDCs攝取VP1-VP4的主要方式。而經(jīng)MR抑制劑或SR抑制劑處理的BMDCs在不同時間出現(xiàn)VP1-VP4抗原攝取量增加的變化，表明MR與SR對VP1-VP4的識別可抑制BMDCs的抗原攝取功能。在經(jīng)溶酶體酶抑制劑處理的BMDCs，可見VP1-VP4-FITC抗原在溶酶體內(nèi)的積累，說明溶酶體在抗原的降解過程中發(fā)揮重要作用。分別抑制Hsp90或蛋白酶體之后，VP1-VP4抗原在BM

5、DCs內(nèi)的聚集均顯著增加。當(dāng)同時抑制Hsp90與蛋白酶體后，這種聚集的增加更加顯著，甚至形成單一的形態(tài)巨大的抗原聚集小泡。這提示Hsp90在將內(nèi)吞小體中的VP1-VP4轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中發(fā)揮重要作用。
　　 用VP1-VP4負(fù)載BMDCs，并與淋巴結(jié)T細胞共培養(yǎng)，然后用流式細胞儀對BMDCs進行檢測，結(jié)果顯示BMDCs表面MHCⅡ表達量升高，CD11c的表達量略有減少，表明VP1-VP4可以活化BMDCs。抑制溶酶體酶的活性之后，M

6、HCⅡ表達量變化較小，但是CD11c表達水平降低。抑制循環(huán)內(nèi)體的轉(zhuǎn)運功能之后，MHCⅡ的表達顯著升高，幾乎呈全陽性表達，在同時抑制循環(huán)內(nèi)體與溶酶體的BMDCs，MHCⅡ表達量更高，同時CD11c的表達也明顯升高，但不同處理組BMDCs的CD80表達水平都非常低，這提示BMDCs還可能存在其他降解VP1-VP4抗原的機制。
　　 用ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，負(fù)載VP1-VP4抗原的BMDCs與T細胞共培養(yǎng)的上清液中含有大量的IFN-γ和

7、IL-17，而IL-4和TGF-β1的含量極低。無論抑制Hsp90、蛋白酶體，還是溶酶體，都會引起IFN-γ水平極顯著降低(P＜0.01)，證明Hsp90、蛋白酶體和溶酶體在FMDVVP1-VP4抗原加工過程中發(fā)揮非常重要的作用。值得注意的是，小劑量Hsp90抑制劑組(200nmol/mL)產(chǎn)生IFN-γ的量高于大劑量組(1μmol/mL)，在各個時間點均有極顯著差異(P＜0.01)，并且Hsp90抑制劑與蛋白酶體抑制劑同時使用后表現(xiàn)相

8、同的趨勢。但是大劑量Hsp90抑制劑（1μmol/mL）與蛋白酶體抑制劑同時使用組產(chǎn)生IFN-γ的量高于單獨使用Hsp90抑制劑組，而小劑量Hsp90抑制劑(200nmol/mL)與蛋白酶體抑制劑同時使用組產(chǎn)生IFN-γ的量低于單獨使用Hsp90抑制劑組。推測當(dāng)Hsp90被高度抑制之后，保存完好的抗原表位可以通過溶酶體途徑進行提呈，產(chǎn)生較高水平的IFN-γ。Primaquine能阻斷內(nèi)吞小體重返細胞膜的過程。在抑制蛋白酶體的前提下，用大

9、劑量Primaquine(100nmol/mL)處理的BMDCs刺激T細胞產(chǎn)生IFN-γ的量遠遠低于小劑量組(50nmol/mL)，這表明交叉提呈途徑在BMDCs提呈VP1-VP4抗原的過程中起著非常重要的作用。
　　 通過對IL-17的檢測發(fā)現(xiàn)，IL-17的含量都非常高（含Chloroquine的處理組除外），并且迅速達到釋放量的峰值（48h之內(nèi)），72和96h各處理組所產(chǎn)生IL-17的量沒有顯著差異（P＞0.05），并且各處

10、理組IL-17檢測水平與本組對應(yīng)時間點上IFN-γ的釋放趨勢保持一致。值得注意的是，IFN-γ的濃度在96h內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)升高的變化趨勢，而IL-17在48h內(nèi)達到峰值。
　　 從以上結(jié)果可以得出結(jié)論:BMDCs主要通過巨吞飲的方式攝取VP1-VP4抗原，在細胞內(nèi)形成包裹VP1-VP4的內(nèi)吞小體，后者與溶酶體融合，VP1-VP4由此被降解，產(chǎn)生的抗原表位與MHCⅡ分子結(jié)合，提呈給CD4+T細胞。內(nèi)吞小體中的VP1-VP4也可被Hsp