內(nèi)蒙古EV71病毒C008株抗VP1血清的制備與中和效果的測(cè)定.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)，屬于小RNA病毒科(Picornavirus)腸道病毒屬(Enterovirus)，是一個(gè)直徑大約30nm的二十面體立體對(duì)稱的小球型結(jié)構(gòu)，無(wú)包膜和突起，由外層衣殼和RNA核心構(gòu)成。近十年間EV71成為亞太地區(qū)手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）的主要病原體。而且感染EV71病毒后有可能出現(xiàn)高燒、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、肺水腫和致死性腦炎。現(xiàn)今針對(duì)EV

2、71感染沒有有效治療藥物，預(yù)防所用的滅活疫苗是否可達(dá)到預(yù)期的效果還有待觀察。同時(shí)EV71病毒分型眾多，不同地區(qū)發(fā)生EV71感染往往呈不同流行特點(diǎn)。了解內(nèi)蒙古本地EV71病毒的分型和作為抗原的性質(zhì)，有助于進(jìn)一步研究更安全有效的疫苗。
　　EV71病毒衣殼顆粒由四種結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP4組成，包圍著約7.4 kb的單股正鏈RNA。除了VP4包埋在病毒粒子的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接外，其他三種結(jié)構(gòu)蛋白均暴露在病毒表面，因此這三種蛋白擁有E

3、V71病毒主要的抗原決定簇。據(jù)研究，VP1基因的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)區(qū)易于變異，這種變異提供了病毒遺傳多樣性，也成為病毒分型的主要依據(jù)。并且，VP1蛋白上的抗原決定簇是病毒抗原性的決定因子，抗體中和反應(yīng)的抗原表位多集中于此。因此在研究EV71病毒的時(shí)候，VP1蛋白的研究成為主要的研究方向，有望成為重組蛋白疫苗。
　　為了深入了解內(nèi)蒙古本地EV71病毒的基因分型和制備針對(duì)EV71病毒VP1蛋白的

4、抗體及重組疫苗，本實(shí)驗(yàn)提取EV71病毒的總RNA，根據(jù)GenBank中儲(chǔ)存的EV71病毒VP1蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物，用一步法RT-PCR得到VP1cDNA約為891 bp。將得到的PCR產(chǎn)物與pET3a載體連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-VP1。再通過設(shè)計(jì)含有HIS標(biāo)簽的引物以pET-VP1載體為模板進(jìn)行PCR，得到了上游帶有HIS標(biāo)簽的VP1 cDNA序列約為909 bp。PCR產(chǎn)物與pET3a連接得到第二種重組表達(dá)載體pET-HIS

5、-VP1。將兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌體中高效表達(dá)，獲得了VP1蛋白和HIS-VP1重組蛋白，SDS-PAGE鑒定蛋白大小約37 kDa。用純化的VP1蛋白和HIS-VP1蛋白免疫BALB/c小鼠，可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抗VP1血清。同時(shí)用EV71病毒免疫BALB/c小鼠，同樣得到了抗EV71病毒的血清。使用上述3種血清進(jìn)行Western Blot和病毒中和實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其保護(hù)作用。
　　Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三種血清