活性氧介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在博萊霉素誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及皮膚組織纖維化中的作用研究.pdf

1、研究背景：硬皮病(Scleroderma)是一種以皮膚、血管和內(nèi)臟器官發(fā)生廣泛纖維化，同時(shí)針對(duì)自身抗原產(chǎn)生一系列自身抗體為特征的全身性結(jié)締組織病。雖然目前仍對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但過量的ECM成分（尤其是膠原成分）在皮膚、內(nèi)臟及血管周圍沉積導(dǎo)致組織器官纖維化是該病的重要特征之一。一般認(rèn)為在纖維化組織器官中膠原合成增加和降解減少導(dǎo)致機(jī)體正常的平衡遭到破壞可能是造成膠原過量沉積的重要原因之一。當(dāng)機(jī)體組織受到內(nèi)外源性因子作用后，成纖維細(xì)胞

2、等將轉(zhuǎn)化成具有收縮和強(qiáng)分泌功能的肌成纖維細(xì)胞，從而大量分泌膠原來修復(fù)組織損傷，當(dāng)肌成纖維細(xì)胞分泌的ECM過量時(shí)，導(dǎo)致ECM在組織細(xì)胞間過量沉積，將會(huì)使組織器官發(fā)生纖維化，從而導(dǎo)致相應(yīng)組織器官出現(xiàn)嚴(yán)重的功能障礙。近年來越來越多的臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明上皮細(xì)胞通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞增加在組織纖維化中的發(fā)揮重要的作用。然而，啟動(dòng)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過

3、程需要細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)因子刺激，從而啟動(dòng)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。近年來，越來越多的研究也顯示活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能也參與調(diào)控上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過程。然而目前對(duì)于皮膚組織纖維化中是否發(fā)生EMT及其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。
　　研究目的：本研究通過對(duì)經(jīng)皮下注射博萊霉素誘導(dǎo)BALB/c小鼠皮膚組織纖維化的硬皮病動(dòng)物模型進(jìn)行研究，探討：⑴博萊霉素能否通過誘導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞增加參與皮膚組織發(fā)生纖維化；⑵

4、活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否在博萊霉素經(jīng)皮注射誘導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT與組織纖維化中可能發(fā)揮一定的作用；⑶活性氧是否參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而通過未折疊蛋白反應(yīng)引發(fā)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT及其分子機(jī)制。
　　研究方法：
　?、艦樘接懖┤R霉素染毒后皮膚組織是否發(fā)生纖維化，通過取染毒部位皮膚組織，將組織處理后經(jīng)H&E染色和天狼星紅染色用于病理學(xué)觀察皮膚厚度及膠原纖維含量變化，并且將新鮮的皮膚組織經(jīng)堿裂解法裂解后用于羥脯氨酸含量檢測(cè)來反

5、映皮膚組織纖維化程度；
　?、茷樘接懫つw纖維化組織中上皮細(xì)胞是否發(fā)生EMT現(xiàn)象，通過病理學(xué)觀察皮膚上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；并且將新鮮皮膚制備冰凍切片，利用免疫熒光檢測(cè)上皮細(xì)胞特征蛋白 E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞特征蛋白Vimentin在皮膚表皮層上皮細(xì)胞中的表達(dá)；同時(shí)將新鮮皮膚組織制備勻漿后，利用蛋白質(zhì)免疫印跡和RT-PCR檢測(cè)E-cadherin和Vimentin蛋白及基因在皮膚組織中的表達(dá)；
　?、菫樘接懫つw纖維化組織

6、中活性氧是否引起氧化應(yīng)激，利用MDA含量反映脂質(zhì)過氧化程度，利用羰基化合物的含量反映蛋白質(zhì)的氧化損傷程度。同時(shí)利用黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)量SOD酶活力，利用過氧化氫與鉬酸銨反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)量CAT酶活力，利用GPX催化GSH的反應(yīng)速度來表示GPX活性，通過檢測(cè)GSR催化NADPH的改變來反映GSR活力，來反映多種抗氧化酶活性變化；
　?、葹樘接懫つw纖維化組織中細(xì)胞是否發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及未折疊蛋白反應(yīng)，利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

7、激特征性蛋白Bip及活化的未折疊反應(yīng)蛋白pIRE1α在皮膚組織中的表達(dá)；并且利用透射電子顯微鏡觀察基底層上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)變化，探討皮膚表皮層中基底膜帶附近上皮細(xì)胞是否發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；
　?、蔀樘接憙?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在誘導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT中的分子機(jī)制，采用化學(xué)伴侶PBA來干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的生物學(xué)效應(yīng)，利用蛋白質(zhì)免疫印跡定量檢測(cè)活化狀態(tài)pSmad2/3和pSrc蛋白在皮膚組織中的表達(dá)情況，探討Smad和Src激酶信號(hào)通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)

8、上皮細(xì)胞發(fā)生 EMT過程中作用；
　?、蕿樘接懟钚匝跏欠袷遣┤R霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT和組織纖維化的上游信號(hào)，采用抗氧化劑NAC來干預(yù)活性氧介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)Bip蛋白和pIRE1α在干預(yù)后皮膚組織中的表達(dá)水平，利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè) E-cadherin和Vimentin在干預(yù)后的皮膚組織中的表達(dá)，同時(shí)利用H&E染色和天狼星紅染色用于病理學(xué)觀察來反映干預(yù)后皮膚厚度及膠原纖維含量變化。

9、r>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：⑴博萊霉素經(jīng)皮注射染毒后導(dǎo)致染毒部位皮膚彈性明顯下降，皮膚出現(xiàn)變硬，皮層厚度增加，并且染毒部位皮膚毛發(fā)生長(zhǎng)緩慢或難以再生，同時(shí)博萊霉素組小鼠體重隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯下降趨勢(shì)。取染毒部位皮膚采用H&E染色和天狼星紅染色后病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)皮膚組織表皮和真皮層厚度及膠原纖維含量明顯增加，并且觀察到炎性細(xì)胞在真皮層中浸潤(rùn)的數(shù)量也明顯增加，皮膚厚度隨染毒時(shí)間呈明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，同時(shí)皮膚厚度和膠原纖維含

10、量在染毒2 wks就開始與對(duì)照組之間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。皮膚組織中羥脯氨酸含量檢測(cè)結(jié)果也顯示，博萊霉素染毒4 wks后的皮膚組織中羥脯氨酸含量較PBS處理組明顯增加，以上結(jié)果表明博萊霉素染毒后皮膚組織中發(fā)生了明顯纖維化；
　?、仆ㄟ^ H&E染色后病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，博萊霉素染毒組皮膚表皮層中臨近基底膜上皮細(xì)胞和毛囊周圍上皮細(xì)胞脫離基底膜的數(shù)量明顯增加，并且染毒3wks組導(dǎo)致臨近基底膜上皮細(xì)胞脫離基底膜的上皮細(xì)胞數(shù)量增加最為明顯，而

11、染毒4wks組的皮膚組織中，表皮層中臨近基底膜上皮細(xì)胞脫離基底膜的數(shù)量較多；免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示博萊霉素處理組皮膚組織中臨近基底膜上皮細(xì)胞和毛囊周圍上皮細(xì)胞中Vimentin蛋白表達(dá)較對(duì)照組也明顯增強(qiáng)；進(jìn)一步利用蛋白質(zhì)免疫印跡和RT-PCR檢測(cè)E-cadherin和Vimentin蛋白及基因在博萊霉素經(jīng)皮注射皮膚組織中的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)皮膚組織中E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)，而Vimentin表達(dá)明顯上調(diào)，E-

12、cadherin蛋白表達(dá)在染毒2 wks，而Vimentin蛋白表達(dá)在染毒3 wks時(shí)開始與PBS對(duì)照組之間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上結(jié)果表明博萊霉素誘導(dǎo)皮膚纖維化組織中上皮細(xì)胞發(fā)生了EMT現(xiàn)象；
　?、峭ㄟ^對(duì)活性氧介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)損傷及抗氧化酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，博萊霉素處理組皮膚組織勻漿中MDA和蛋白質(zhì)羰基含量較PBS處理組明顯增加，抗氧化劑NAC能明顯抑制MDA和蛋白質(zhì)羰基含量增加，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)分析，兩者之間差別都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義；對(duì)抗氧化酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)博萊霉素處理組皮膚組織勻漿中SOD酶活力較PBS處理組明顯增加，博萊霉素處理組CAT和GPX酶活力較PBS處理組變化不明顯，但博萊霉素處理組GSR酶活力較PBS處理組明顯下降，以上結(jié)果表明博萊霉素能明顯誘導(dǎo)皮膚組織發(fā)生氧化應(yīng)激；
　　⑷通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特征性蛋白 Bip在皮膚組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，博萊霉素染毒組皮膚組織中Bip表達(dá)水平從2W開始較PBS對(duì)照組明顯增加，呈現(xiàn)時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，并且

14、經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。透射電子顯微鏡觀察基底層上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)變化，觀察結(jié)果顯示基底層上皮細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)在博萊霉素染毒2wks即出現(xiàn)明顯的擴(kuò)張，在博萊霉素染毒3wks時(shí)擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯增多?；瘜W(xué)分子伴侶 PBA能抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白 Bip和未折疊反應(yīng)蛋白pIRE1α表達(dá)，并且PBA干預(yù)后能夠能夠抑制博萊霉素致皮膚組織中E-cadherin表達(dá)下調(diào)和Vimentin表達(dá)水平增高，以上結(jié)果表明博

15、萊霉素能夠誘導(dǎo)皮膚組織發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與調(diào)控上皮細(xì)胞發(fā)生 EMT過程；
　　⑸通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)pSmad2/3和pSrc蛋白質(zhì)在博萊霉素經(jīng)皮注射3wks后的皮膚組織中的表達(dá)情況及PBA的干預(yù)作用，結(jié)果顯示博萊霉素能明顯誘導(dǎo)pSmad2/3和pSrc蛋白質(zhì)在皮膚組織中的表達(dá)，并且PBA能明顯抑制博萊霉素誘導(dǎo)pSmad2/3和pSrc蛋白質(zhì)在皮膚組織中的表達(dá)，以上結(jié)果提示Smad2/3和Src介導(dǎo)的信號(hào)通路可能參

16、與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT；
　　⑹利用抗氧化劑NAC來干預(yù)活性氧介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，結(jié)果顯示NAC能夠抑制Bip和pIRE1α在皮膚組織中的表達(dá)水平，抑制博萊霉素誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)下調(diào)和Vimentin表達(dá)上調(diào)，同時(shí)抑制皮膚組織纖維化，以上結(jié)果表明活性氧可能作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT和組織纖維化的上游信號(hào)分子。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：在博萊霉素經(jīng)皮注射誘導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT及組織纖維化中，大量

17、氧自由基可能通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)中IRE1蛋白激活，IRE1可通過使Smad2/3激酶發(fā)生磷酸化從而激活其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin表達(dá)；或者可能通過激活Src激酶，繼而激活其信號(hào)通路使E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間連接發(fā)生重構(gòu)，或通過胞吞進(jìn)入胞漿使其降解，最終使皮膚組織上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后進(jìn)一步增加了皮膚組織中肌成纖