內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路在納米ZnO誘導(dǎo)小鼠肝毒性中的作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　納米ZnO優(yōu)良的光催化作用、抗菌性能、紫外線吸收能力及選擇性殺傷癌細(xì)胞的作用，使其成為倍受青睞的一種納米材料，廣泛用于電子行業(yè)、食品工業(yè)、化妝品及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。納米ZnO的廣泛應(yīng)用已引起了人類對(duì)其生物安全性的關(guān)注。近年來有關(guān)納米ZnO安全性評(píng)價(jià)的研究發(fā)現(xiàn):在細(xì)胞水平，納米ZnO可引起細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡等改變;在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，納米ZnO通過灌胃、氣管灌注、吸入、注射等途徑進(jìn)入體內(nèi)后，再通過血液循環(huán)

2、到達(dá)全身各個(gè)器官，如心、肝、脾、肺、腎等，并損傷其功能。已有研究證實(shí)，口服進(jìn)入體內(nèi)的納米ZnO可通過胃腸靜脈系統(tǒng)吸收入肝臟并通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起肝細(xì)胞凋亡。但是，具體的分子機(jī)制并不清楚。
　　目前，氧化應(yīng)激是國內(nèi)外公認(rèn)的納米材料的主要損傷機(jī)制。而氧化應(yīng)激是如何觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路并在納米材料誘導(dǎo)的肝損傷中起作用的？凋亡是程序性的細(xì)胞死亡，目前已知的3條凋亡途徑包括死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成

3、、翻譯后修飾、折疊和組裝的場所，也是細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存的場所，與物質(zhì)運(yùn)輸、物質(zhì)交換、解毒作用密切相關(guān)。肝細(xì)胞內(nèi)含有大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，氧化應(yīng)激、缺血再灌注損傷及各種毒物都可影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，繼而引起細(xì)胞凋亡、肝損傷等一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此我們提出這樣的假設(shè):在納米ZnO誘導(dǎo)小鼠肝毒性中，ROS損傷了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路，引起肝細(xì)胞損傷。
　　目的:
　　確認(rèn)口服納米ZnO后對(duì)小鼠

4、肝臟的亞急性及慢性損傷作用，闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路在納米ZnO誘導(dǎo)的中毒性肝損傷中的作用及機(jī)制，揭示納米ZnO引起的中毒性肝損傷的發(fā)病機(jī)制，為中毒性肝損傷的防治提供新思路，并為納米ZnO的生物安全性研究提供新數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　1.亞急性肝毒性模型:實(shí)驗(yàn)用50只C57雄性小鼠（6周齡，體重20-22 g），每組10只，隨機(jī)分成納米ZnO組(100、200、400、600 mg/Kg)和生理鹽水對(duì)照組，連續(xù)灌胃14天，以建

5、立納米ZnO的亞急性肝損傷模型。檢測血清中肝功能指標(biāo)ALT、AST、ALP水平;HE染色后光鏡下觀察肝臟組織病理改變;檢測肝組織勻漿氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)SOD、MDA; ELISA法測定肝組織勻漿凋亡蛋白Caspase3、Caspase9、Caspase12的含量;RT-PCR法檢測凋亡相關(guān)基因bcl-1、bcl-2、bax及GRP94的mRNA表達(dá)水平。
　　2.慢性肝毒性模型:實(shí)驗(yàn)用50只C57雄性小鼠（6周齡，體重20-22g）

6、，每組10只，隨機(jī)分成納米ZnO組（200 mg/Kg、400 mg/Kg）、普通ZnO組(200mg/Kg、400 mg/Kg)和生理鹽水對(duì)照組，連續(xù)灌胃90天，以建立納米ZnO的慢性肝損傷模型。檢測血清中肝功能指標(biāo).ALT、AST、ALP水平;HE染色后光鏡下觀察肝臟組織病理改變;檢測肝組織勻漿氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)SOD、MDA、GSH;ELISA法測定肝組織勻漿凋亡蛋白Caspase3、Caspase9、Caspase12的含量;RT

7、-PCR法檢測凋亡相關(guān)基因bcl-1、bcl-2、bax及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因CHOP、GRP94、 GRP78、PDI、XBP-1的mRNA表達(dá)水平;Western blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白PERK、p-PERK、Eif2α、p-Eif2α、JNK、p-JNK及凋亡蛋白CHOP的蛋白表達(dá)水平;透射電鏡觀察肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)及結(jié)構(gòu)的變化;免疫組化法檢測肝組織中CHOP的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　在不同濃度納米ZnO誘導(dǎo)的

8、亞急性肝毒性模型中，血清肝功能指標(biāo)ALT在納米ZnO組（200 mg/Kg、600mg/Kg）中明顯升高，ALP在納米ZnO組(400 mg/Kg、600mg/Kg)中明顯升高，其改變與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);肝組織病理結(jié)果變化不明顯，僅在（100 mg/Kg、200 mg/Kg）納米ZnO組中見炎癥細(xì)胞浸潤和少量點(diǎn)狀壞死;納米ZnO組中肝組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA水平均明顯升高(P＜0.05)肝組織勻漿中凋亡蛋

9、白Caspase12含量在納米ZnO組(200、400、600 mg/Kg)中均明顯升高(P＜0.01)，Caspase9含量在納米ZnO組（600 mg/Kg）中明顯升高(P＜0.05);抗凋亡基因bcl-1、bcl-2在納米ZnO組表達(dá)水平明顯降低，而促凋亡基因bax及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶基因GRP94表達(dá)水平上調(diào)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　在納米ZnO誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型中，血清肝功能指標(biāo)ALT、AST在納米Zn

10、O組（200 mg/Kg、400 mg/Kg）中均明顯升高，其改變與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);肝組織病理結(jié)果顯示，在納米ZnO組可見灶狀壞死及中央靜脈擴(kuò)張淤血;納米ZnO組中氧化應(yīng)激水平明顯升高，表現(xiàn)為:與對(duì)照組比較，其GSH水平明顯降低;而MDA、SOD水平明顯升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);納米ZnO組中Caspase3、Caspase9、Caspase12的含量與對(duì)照組比較均明顯升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

11、＜0.05);納米ZnO組抗凋亡基因bcl-1、bcl-2基因表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，且促凋亡基因bax、CHOP基因表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;納米ZnO組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因GRP94、GRP78、PDI、XBP-1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米ZnO組p-Eif2α、p-JNK、p-PERK、CHOP蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組;電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)

12、及形態(tài)發(fā)現(xiàn)納米ZnO組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，核糖體脫顆粒明顯，對(duì)照組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常;免疫組化結(jié)果表明，納米ZnO組的CHOP表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組及普通ZnO組。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)條件下，反復(fù)灌胃不同濃度(100、200、400、600 mg/Kg)的納米ZnO造成的小鼠亞急性肝毒性，主要是通過氧化應(yīng)激機(jī)制介導(dǎo)，其損傷程度與納米ZnO的灌胃濃度無明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。納米ZnO灌胃小鼠的慢性肝毒性模型證實(shí)，納米ZnO灌胃小鼠后誘導(dǎo)