抗草魚CD4l-2單克隆抗體的制備及其應(yīng)用研究.pdf

1、目的：CD4為重要的淋巴細(xì)胞表面分子，屬于免疫球蛋白家族膜錨定蛋白，與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合，參與Th細(xì)胞TCR識(shí)別抗原的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生相關(guān)免疫應(yīng)答。草魚是我國主要養(yǎng)殖魚類，也是低等脊椎動(dòng)物中硬骨魚類的代表物種，對(duì)其免疫系統(tǒng)的研究有助于了解免疫系統(tǒng)的多樣性以及脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的進(jìn)化，也可為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的病害防治提供理論依據(jù)。本研究旨在制備抗草魚CD4L-2單克隆抗體，并分選出CD4L-2+細(xì)胞，為T細(xì)胞亞群分類及其功能研究奠定基礎(chǔ)。

2、>　　方法：基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的草魚CD4L-2基因信息設(shè)計(jì)特異引物，采用PCR技術(shù)分離草魚腸道CD4L-2基因;應(yīng)用qPCR方法分析草魚CD4L-2基因的表達(dá)譜。原核表達(dá)抗原性較強(qiáng)的CD4L-2胞外段蛋白，以重組蛋白免疫小鼠獲多抗;雜交瘤技術(shù)制備相應(yīng)的mAb，并利用CIK細(xì)胞間接免疫熒光、Western blot、間接ELISA等方法檢測(cè)其特異度與效價(jià)。采用Protein G親和色譜法純化抗草魚CD4L-2的mAb，IAC技術(shù)純化獲得

3、CIK細(xì)胞內(nèi)靶蛋白，質(zhì)譜分析靶蛋白與預(yù)測(cè)的草魚CD4L-2蛋白的一致性。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分選檢測(cè)用PHA刺激草魚前后的各免疫相關(guān)組織中CD4L-2+細(xì)胞比例變化特征;激光共聚焦鑒定草魚腸粘膜中表達(dá)CD4L-2基因的細(xì)胞類型。
　　結(jié)果：草魚CD4L-2基因的ORF長(zhǎng)1290 bp，編碼429個(gè)氨基酸，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)三部分。胞外區(qū)含有3個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域(V1-C1-C2)，胞質(zhì)區(qū)包含保守的CXC基序。該CD4L-2分子胞外區(qū)

4、存在多個(gè)保守性位點(diǎn)，如C1結(jié)構(gòu)域中的WTC基序以及V1、C1和C2結(jié)構(gòu)域中的N糖基化位點(diǎn)等。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，草魚CD4L-2與斑馬魚、日本關(guān)東鯽、斑點(diǎn)叉尾鲴等魚類的親緣關(guān)系較近，草魚CD4L-2基因表達(dá)于各種組織，表達(dá)量從高到低的順序?yàn)檠?、體腎、心臟、頭腎、腸道、脾臟、鰓、胸腺、肝臟、鰭、肌肉、表皮等組織，也表達(dá)于腎細(xì)胞(CIK)中。獲得的抗草魚CD4L-2多抗與單抗的效價(jià)分別為1∶64000與1∶160000（雜交瘤細(xì)胞的保藏號(hào)

5、為:CCTCC C2015189）。CIK細(xì)胞間接免疫熒光與Western blot分析結(jié)果顯示，所制備的抗草魚CD4L-2單克隆抗體能特異性識(shí)別自然狀態(tài)下折疊的CD4L-2蛋白。質(zhì)譜分析顯示，靶蛋白與預(yù)測(cè)的草魚CD4L-2蛋白的一致性可達(dá)66％。健康草魚多數(shù)組織中含有CD4L-2+細(xì)胞，其在組織細(xì)胞中的百分比從高到低的順序?yàn)樾叵?、鰓、肝臟、腸道、脾臟、頭腎、體腎、血液，其中，胸腺的CD4L-2+細(xì)胞含量極顯著地高于血液與體腎(p＜0.

6、01)，鰓、肝臟和腸道中CD4L-2+細(xì)胞含量顯著高于血液與體腎(p＜0.05)。用PHA刺激48h后，各免疫相關(guān)組織中CD4L-2+細(xì)胞比例發(fā)生了明顯變化，其中，頭腎、脾臟、肝臟與腸道中CD4L-2+細(xì)胞比例顯著升高，而胸腺中CD4L-2+細(xì)胞比例有所下降。激光共聚焦分析顯示，腸粘膜中嗜酸性細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等均為CD4L-2+細(xì)胞。
　　結(jié)論：本研究克隆了草魚CD4L-2基因，制備并鑒定了抗草魚CD4L-2單