Aβ寡聚體單克隆抗體的制備及功能研究.pdf

1、阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種常見(jiàn)的漸進(jìn)性神經(jīng)退行性疾病。其典型的病理特征為大腦皮層及海馬區(qū)的β淀粉樣肽（Amyloid β-peptide，Aβ）在胞外積累并形成老年斑（senile plaque，SP）、腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)tau蛋白異常聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT）以及神經(jīng)元突觸功能異常及錐體神經(jīng)細(xì)胞丟失。目前認(rèn)為Aβ是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及認(rèn)知功能障礙的主要

2、致病物質(zhì)。研究表明，針對(duì)Aβ的主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫療法可以減少轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦內(nèi)聚集的Aβ纖維，并且能夠明顯改善模型小鼠的認(rèn)知能力。 本課題主要進(jìn)行了Aβ1-42寡聚體單克隆抗體（McAb，以下簡(jiǎn)稱單抗）的制備、鑒定以及其體內(nèi)、外功能研究?！　∫?、Aβ寡聚體單抗的制備及性質(zhì)鑒定。 在體外將化學(xué)合成的Aβ1-42聚合成Aβ寡聚體，用Aβ寡聚體免疫小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，通過(guò)有限稀釋法克隆和間接E

3、LISA篩選，獲得穩(wěn)定分泌Aβ寡聚體單抗的雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔誘生腹水，采用A蛋白親和層析從腹水中純化制備Aβ單抗。并通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)純化后抗體的純度，Western Blot檢測(cè)單抗對(duì)Aβ寡聚體的識(shí)別，競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定單抗的抗原識(shí)別表位與親和常數(shù)。結(jié)果顯示：獲得一株穩(wěn)定分泌Aβ寡聚體單抗的雜交瘤細(xì)胞株（A8），純化后單抗A8的純度達(dá)到95％以上。A8對(duì)16．5-25 KD的Aβ寡聚體有較高的親和力，為IgG

4、3亞類，抗原識(shí)別表位位于Aβ分子N端的1-6位氨基酸，親和常數(shù)為7．89×10-8?！　?二、A8單抗的體外及體內(nèi)生物學(xué)活性研究。 為了解單抗A8對(duì)Aβ寡聚體誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，以Aβ寡聚體誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷，用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果顯示：1μmol/L單抗A8可顯著降低20 μmol/L Aβ寡聚體對(duì)細(xì)胞的毒性作用（p<0．05）。所以單抗A8可以在體外抑制Aβ寡聚體對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的

5、毒性。 隨后利用SAMP8模型小鼠，對(duì)單抗A8的治療作用進(jìn)行了探討，取8周齡SAMP8小鼠腹腔注射A8（500 μg/只），治療結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，之后處死小鼠取腦，做石蠟切片免疫組化分析，并對(duì)鼠腦全蛋白做Western Blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，治療組小鼠行為學(xué)有一定改善，大腦中的Aβ水平及磷酸化tau蛋白降低（p<0．05），tau蛋白沒(méi)有變化。 三、A8單抗輕鏈重鏈可變區(qū)基因的克隆與分析。

6、 人源化改造是鼠源單抗用于人體的重要基礎(chǔ)，為此采用5'RACE法擴(kuò)增與克隆了A8單抗的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因，并克隆入pMD18-T載體中。測(cè)序結(jié)果顯示重鏈可變區(qū)基因序列全長(zhǎng)450 bp，編碼150個(gè)氨基酸；輕鏈可變區(qū)基因序列全長(zhǎng)429 bp，編碼143個(gè)氨基酸。在GeneBank對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，二者均符合小鼠IgG可變區(qū)基因的特征。 總之，本研究成功制備并獲得了Aβ寡聚體單抗A8，該抗體對(duì)Aβ寡聚體有較高的親和力，為I