HBV前S2單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：研究表明，HBV前S2具有PHSA受體，可介導(dǎo)HBV病毒顆粒吸附到肝細(xì)胞表面，在乙型肝炎入侵肝細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，前S2蛋白上含有多個(gè)特異性T、B淋巴細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，能引起中和抗體和保護(hù)性免疫的發(fā)生。因此，本研究首先擬構(gòu)建含乙型肝炎病毒(HBV)PreS2基因的原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中高效表達(dá)，獲得純化的PreS2融合蛋白，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行鑒定。然后利用雜交瘤技術(shù)制備小鼠抗乙型肝炎病毒PreS2的單克隆抗體。作為進(jìn)一步研究乙型肝炎病

2、毒PreS2生物學(xué)功能以及PreS2在HBV感染中作用的工具。為預(yù)防和治療乙型肝炎提供新的思路。 方法： 1.采用PCR法擴(kuò)增含BglⅡ與SalⅠ酶切位點(diǎn)的PreS2基因片段，原核表達(dá)載體pGST-MOLUC及PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后，用T4DNA連接酶將兩者連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109構(gòu)建并篩選重組質(zhì)粒。隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和Weste

3、rn-blot檢測。以谷胱甘肽-Sepharose 4B凝膠為填料進(jìn)一步采用親和層析純化融合蛋白。 2.用PreS2融合蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，制備抗PreS1的單克隆抗體，用ELISA方法來篩選能分泌抗PreS2單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞克隆，采用間接ELISA方法和Western-blot進(jìn)行mAb特異性鑒定；同時(shí)采用間接ELISA方法鑒定mAb的Ig亞類，檢測mAb的效價(jià)及相對(duì)親和力，并進(jìn)行mAb

4、結(jié)合表位分析。并對(duì)其染色體進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1.用PCR方法擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的基因片段。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定及測序分析證實(shí)重組質(zhì)?？寺〕晒Γ麨閜GST-PreS2。轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌后成功誘導(dǎo)出分子量為33kD的GST-PreS2融合蛋白，與預(yù)期分子量相符，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白約占總菌蛋白的10％左右。Western-blot檢測表明誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白能分別與抗GST的單抗和抗PreS2的單抗發(fā)生特異性結(jié)合。采用谷

5、胱甘肽-Septlarose 4B凝膠純化融合蛋白，純化蛋白純度約為90％左右。 2.成功篩選出兩株可分泌特異性mAb的雜交瘤細(xì)胞7A61和5E73，其抗體亞類為IgG1；將生長良好的雜交瘤細(xì)胞接種到預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔中制備腹水型PreS2的單克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)證明腹水效價(jià)可達(dá)10 -7； Western-blot結(jié)果鑒定提示該單克隆抗體可以特異的結(jié)合PreS2。ELISA相加實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2株mA