藏藥抗菌抗病毒作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：對甘肅甘南采集的清熱解毒類藏藥異葉青蘭、甘青烏頭、獐芽菜、烏奴龍膽、五脈綠絨蒿、鐵棒錘、蒺藜、兔耳草提取物進(jìn)行了抑菌活性試驗(yàn)；對異葉青蘭，甘青烏頭，獐芽菜提取物進(jìn)行了的體內(nèi)外抗HSV-2的作用研究，并探討了這些提取物的抗病毒作用機(jī)制。最終希望通過上述基礎(chǔ)研究獲得抗菌抗病毒活性強(qiáng)的藏藥。 方法： 1．藏藥體外抗菌活性研究：采用瓊脂擴(kuò)散法和微量稀釋法，以抑菌圈和最小抑菌濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo)對八種藏藥的水提取物和醇提取物以及異

2、葉青蘭揮發(fā)油和甘青烏頭生物堿進(jìn)行了體外抑菌活性的初步研究。 2．揮發(fā)油成分分析：以GS-MS聯(lián)用技術(shù)分析異葉青蘭揮發(fā)油化學(xué)成分及相對含量。 3．藏藥體外抗病毒活性研究：MTT法測定藏藥對Vero細(xì)胞的毒性，以阿昔洛韋為陽性對照藥物，采用細(xì)胞病變法、蝕斑法和透射電鏡觀察考察了異葉青蘭、甘青烏頭、獐芽菜體外抗病毒活性。 4．藏藥體內(nèi)抗病毒作用：用HSV-2分別建立小鼠腦炎模型與小鼠生殖器感染模型，以阿昔洛韋作為陽性對

3、照藥物，對異葉青蘭、甘青烏頭、獐芽菜體內(nèi)抗單純皰疹病毒的抗病毒活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 5．藏藥抗HSV-2的作用機(jī)制：采用定量熒光PCR法、掃描電鏡觀察和蝕斑法考察了異葉青蘭、甘青烏頭、獐芽菜體外抗病毒作用機(jī)制。 結(jié)果： 1．藏藥體外抗菌活性研究： a．藏藥水提取物和醇提取物對所選菌種都具有一定的抑制作用，形成抑菌圈直徑范圍為8～22cm，MIC范圍為1.56-50.00mg/ml。其中異葉青蘭和甘青烏頭抑菌活性

4、最強(qiáng)，五脈綠絨蒿基本沒有抑菌作用。 b．異葉青蘭精油能抑制細(xì)菌和酵母樣真菌的生長，抑菌圈和最小抑菌濃度MIC范圍分別為18-25mm，和0.039-0.156mg/ml。 C．甘青烏頭脂溶性生物堿的最小抑菌濃度MIC除對白色念球菌為0.313mg/ml，對其他菌均為1.25mg/ml，水溶性生物堿的最小抑菌濃度MIC除對糞腸球菌為0.625mg/ml，對其他菌均為5.0mg/ml。 2．異葉青蘭精油化學(xué)成分：46

5、.17％屬單萜類，28.82％屬倍半萜類。從精油中共鑒定出83種主要成分，總含量占全油的89.83％。 3．藏藥體外抗病毒活性研究：異葉青蘭、甘青烏頭、獐芽菜、阿昔洛韋對Vero細(xì)胞的半數(shù)中毒濃度(CC<,50>)分別為8.43mg/mL，5.54mg/ml，3.23mg/ml，11.02mg/ml。細(xì)胞病變法測得異葉青蘭、甘青烏頭、獐芽菜、阿昔洛韋抑制HSV-2的EC<,50>分別為1.13mg/ml，0.53mg/ml，1.

6、51mg/ml，1.64mg/ml。蝕斑法測得異葉青蘭、甘青烏頭、獐芽菜和阿昔洛韋的EC<,50>分別為0.99mg/ml，1.43mg/ml，3.60mg/ml，0.29mg/ml。治療指數(shù)TI則分別為8.91，6.36，1.05，37.4。用透射電鏡觀察Vero細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和病毒，發(fā)現(xiàn)給藥后病毒被明顯抑制。 4．藏藥體內(nèi)抗病毒作用：異葉青蘭、甘青烏頭、獐芽菜腹腔注射的LD<,50>值分別為15.00，0.85，19.13g

7、/kg。在小鼠腦炎模型中，甘青烏頭只延長了小鼠的平均存活時(shí)間，對小鼠的死亡未顯示出明顯的保護(hù)率。異葉青蘭在劑量為0.5，1.00g/kg治療時(shí)，對小鼠的保護(hù)率分別為20％，10％，獐芽菜在劑量為1.00，2.00g/kg治療時(shí)，對小鼠的保護(hù)率分別為40％，20％。 5．減藥抗HSV-2的作用機(jī)制： a. 不同給藥方式下蝕斑減少試驗(yàn)結(jié)果表明：異葉青蘭、甘青烏頭、獐芽菜均能直接滅活HSV-2，能夠顯著抑制HSV-2的感染性；

8、異葉青蘭可顯著抑制HSV-2對Vero細(xì)胞的吸附侵入作用，獐芽菜對病毒的吸附抑制作用弱，而甘青烏頭沒有抑制作用；異葉青蘭、甘青烏頭、獐芽菜均能抑制HSV-2大分子的增值。 b. 掃描電鏡觀察異葉青蘭抑制HSV-2對Vero細(xì)胞吸附的情況，進(jìn)一步證實(shí)異葉青蘭可顯著抑制HSV-2對Vero細(xì)胞吸附。 C. 熒光定量PCR結(jié)果表明異葉青蘭、甘青烏頭和獐芽菜抑制HSV-2 DNA合成的抑制倍數(shù)分別達(dá)10<'6>、10<'2>、1

9、0<'3>。 結(jié)論： 1．抑菌測定結(jié)果表明：八種藏藥水提取物，抑菌活性異葉青蘭>甘青烏頭>獐芽菜>兔耳草>鐵棒錘>蒺藜>烏奴龍膽>五脈綠絨蒿；而對于醇提取物，異葉青蘭>甘青烏頭>鐵棒錘>兔耳草>蒺藜>獐芽菜>烏奴龍膽>五脈綠絨蒿。甘青烏頭脂溶性生物堿抑菌作用強(qiáng)于水溶性生物堿。異葉青蘭揮發(fā)油具有很強(qiáng)的抑菌活性，而且其抑菌活性與高含量的單萜和倍半萜有關(guān)。 2．異葉青蘭、甘青烏頭、獐芽菜具有較強(qiáng)的抗HSV-2的活性，C