抗病毒活性物質(zhì)的純化分離及抗病毒譜的初步探討.pdf

1、上世紀(jì)發(fā)現(xiàn)抗菌抗生素以來，細(xì)菌性疾病已經(jīng)得到有效控制，此為尋找抗病毒抗生素提供了研究途徑。本研究就是在獲得一株可產(chǎn)生抗病毒活性成分的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了有效成分的提取分離純化，并進(jìn)行了抗病毒譜、抗病毒機(jī)制的初步研究。 [目的]分離、確定真菌發(fā)酵物中的抗病毒成分，初步探討抗病毒譜。 [方法] 1抗病毒活性物質(zhì)的分離：用丙酮/乙酸乙酯提取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)從發(fā)酵菌絲中獲取酯相，然后過硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯混合液洗脫(洗脫梯度為

2、15∶1、12∶1、10∶1、8∶1)，分部收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸干后測(cè)定抗病毒活性，然后將活性組分通過HPLC制備分離單峰化合物和混合峰組分，然后將單峰物質(zhì)做紫外光譜、質(zhì)譜、核磁共振炭譜和氫譜分析。 2抗病毒譜的初步探索：用體外抗病毒試驗(yàn)方法將硅膠柱石油醚/乙酸乙酯(10∶1)洗脫組分(簡(jiǎn)稱柱洗脫組分)與單峰化合物做多科病毒的體外抑毒試驗(yàn)，病毒包括：皰疹科病毒(HCMV、HSV-1、HSV-2)、副粘病毒科病毒(RSV)、腺病毒(

3、Ad3)、腸道病毒(COXB1-6)、彈狀病毒科病毒(VSV)、呼腸孤病毒科病毒(輪狀病毒，RVAS11)、正粘科病毒(流感甲地方株、流感乙地方株)15株病毒。 3抗病毒機(jī)制的初步探討： ①探討柱洗脫組分和jn219是在病毒哪個(gè)復(fù)制周期外使病毒喪失感染能力(用HCMV作為測(cè)活依據(jù))：首先將藥物與病毒在37℃作用1h后、與病毒同時(shí)、病毒感染1h使病毒完成穿入過程后接種藥物到多孔板細(xì)胞上，根據(jù)細(xì)胞病變判斷藥物作用效果；

4、 ②在初步確定藥物在細(xì)胞外即可使病毒喪失感染能力的基礎(chǔ)上，將紫外線滅活的病毒與藥物作用后，觀察滅活的病毒是否競(jìng)爭(zhēng)了藥物的抗病毒活性。 4純化合物jn219抗病毒活性穩(wěn)定試驗(yàn)：將jn219存放于4℃，30d后做抗病毒試驗(yàn)，通過與存放前測(cè)定結(jié)果的比較，探討其抗病毒活性的穩(wěn)定性。 [結(jié)果] 1抗病毒活性物質(zhì)的分離：真菌產(chǎn)物用丙酮/乙酸乙酯分離成水相和酯相，活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)兩相中均有顯著抗病毒活性，鑒于酯相分離簡(jiǎn)便，故選擇

5、酯相做進(jìn)一步分離。首先用硅膠柱分離，發(fā)現(xiàn)在石油醚/乙酸乙酯之10/1提取相(簡(jiǎn)稱柱洗脫組分)具有高效抗病毒活性，用制備型高壓液相色譜進(jìn)一步分離，獲得一單峰物質(zhì)(命名為jn219，)和數(shù)個(gè)混合峰組分(分別編號(hào)1、2、3、4號(hào))。jn219紫外吸收高峰在220nm，質(zhì)譜分析其分子量為519道爾頓，活性跟蹤發(fā)現(xiàn)jn219和混合峰組分1號(hào)均有抗病毒活性。 但核磁共振炭譜和氫譜化學(xué)移位雜亂，不能計(jì)算出炭氫數(shù)目，未能推測(cè)出分子結(jié)構(gòu)。

6、 2抗病毒譜的初步探討：通過抑毒試驗(yàn)，證明柱洗脫組分和jn219對(duì)HCMMV、VSV、RV具有良好的抗病毒活性，而對(duì)HSV-1、HSV-2、RSV、有弱抗病毒活性，對(duì)AD3、COX-B1-6無顯著抗病毒效果。 3抗病毒機(jī)制的初步探討：柱洗脫組分和jn219與毒液細(xì)胞外作用1h后可使HCMV喪失感染能力，而先將jn219接種細(xì)胞然后用病毒攻擊則不能全部抑制HCMV病變的發(fā)生；并且紫外滅活的HCMV可競(jìng)爭(zhēng)抑制柱洗脫組分和jn219的

7、抗病毒活性，表明柱洗脫組分和jn219的抗病毒作用主要與阻斷HCMV的穿入、融合過程有關(guān)。 4純化合物jn219抗病毒活性穩(wěn)定試驗(yàn)：jn21930d前半數(shù)有效濃度為0.4ug/ml儲(chǔ)存30d后半數(shù)有效濃度為39.7ug/ml，與儲(chǔ)存前比較，30d活性降低99.25倍。 [結(jié)論] 1獲取真菌代謝產(chǎn)物抗病毒有效組分和純化合物jn219； 2探索了分離提純jn219的方法，為大量提取奠定基礎(chǔ)； 3初步探