日本血吸蟲大陸株硫氧還蛋白在畢氏酵母菌的克隆表達(dá)及其免疫反應(yīng)性研究.pdf

1、血吸蟲病(Schistosomiasis)是嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，也是我國(guó)當(dāng)前防治的重點(diǎn)傳染病之一。至2005年，全國(guó)有疫情未控制縣(市、區(qū)，簡(jiǎn)稱縣)105個(gè)，疫情回升縣38個(gè)，血吸蟲病人79.8萬，釘螺面積38.6億平方米，且每年都有急性血吸蟲病例發(fā)生，血吸蟲病防治形勢(shì)依然嚴(yán)峻，防治工作任重而道遠(yuǎn)。 控制血吸蟲病關(guān)鍵之一就是要及時(shí)和準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)病人，因此血吸蟲病診斷在查病治病體系中始終處于中心位置。病原學(xué)檢查是血吸

2、蟲病確診的唯一手段，但其敏感性和依從性較低。免疫學(xué)診斷技術(shù)具有較高的敏感性和特異性，可彌補(bǔ)病原學(xué)檢查不足，因此已逐漸整合到我國(guó)血吸蟲病防治工作中。 目前常用的血吸蟲抗體檢測(cè)技術(shù)的敏感性多在90％以上，但其特異性尚待提高，如與健康者假陽性率多在3％～5％之間，與并殖吸蟲、華支睪吸蟲、旋毛蟲的交叉反應(yīng)率分別在10％～17％、4％～10％和8％～13％之間。主要原因是血吸蟲與其它寄生蟲之間存在著相同或相似抗原表位。 免疫診斷技

3、術(shù)特異性的關(guān)鍵取決于抗原的純度。目前常用血吸蟲病診斷抗原多為蟲卵或成蟲粗制抗原，有成份復(fù)雜、交叉反應(yīng)率偏高等缺陷。而成分抗原也存在制備過程復(fù)雜，抗原得量較少，似不具備推廣價(jià)值。隨著基因重組技術(shù)的快速發(fā)展和在血吸蟲病免疫診斷中的應(yīng)用，有可能為改善免疫診斷方法提供新手段。例如，可進(jìn)一步提高診斷方法的特異性，制備的重組抗原易于標(biāo)準(zhǔn)化，并進(jìn)入工業(yè)化批量生產(chǎn)的程序。因此，篩選并克隆表達(dá)極具診斷價(jià)值潛能的新型重組抗原作為特異性診斷抗原，對(duì)血吸蟲病診

4、斷工作具有很大的現(xiàn)實(shí)意義。 日本血吸蟲大陸株硫氧還蛋白(SjcTrX)由106個(gè)氨基酸組成，分子量約為12kDa，在蟲體內(nèi)分布廣，具有氧化還原調(diào)節(jié)功能和多種生物學(xué)活性，是血吸蟲存活過程中的一個(gè)非常重要的生理分子。已有研究表明曼氏血吸蟲Trx具有較好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，有可能成為理想的免疫診斷抗原。 原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中表達(dá)的蛋白缺乏翻譯后的修飾和糖基化，其抗原活性較低。而畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的蛋白質(zhì)真核表

5、達(dá)系統(tǒng)，既有原核生物生長(zhǎng)快、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，又有哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工和修飾的功能，分泌表達(dá)產(chǎn)物無過度糖基化且易于純化，因此具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。 為探討sjcTrx重組抗原作為日本血吸蟲病特異性診斷抗原的可能性，本研究開展SjcTrx編碼基因在畢氏酵母菌克隆和表達(dá)工作，并進(jìn)行了免疫反應(yīng)性的研究。 首先，根據(jù)公布的日本血吸蟲菲律賓株Trx基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和起始密碼子ATG，下

6、游引物引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)。以日本血吸蟲大陸株成蟲總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄--聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增SjcTrx基因。雙酶切并純化的PCR產(chǎn)物與同樣雙酶切并純化的含AOX1啟動(dòng)子pPICZαA質(zhì)粒DNA片段用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-SjcTrx，轉(zhuǎn)入至大腸桿菌Top10，獲得高拷貝重組質(zhì)粒。經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切、PCR擴(kuò)增和核苷酸序列鑒定正確后，用BstXⅠ酶單切重組質(zhì)粒pPICZαA-SjcTrx

7、使其線性化，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)X-33畢氏酵母菌。用含有100μg/mlZeocin的YPDS平板篩選集落，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后用Pichia pastoris EasySelect<'TM>表達(dá)系統(tǒng)BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，用甲醇誘導(dǎo)AOX1啟動(dòng)子表達(dá)產(chǎn)生可溶性重組SjcTrx蛋白。SDS-PAGE分析組SjcTrx蛋白，Ni<'2+>吸附組氨酸標(biāo)記的親和層析法純化，Western blotting觀察重組SjcTrx蛋白的免疫反應(yīng)性。研究結(jié)果顯示，S

8、jcTrx編碼基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約335bp，分子量與預(yù)計(jì)大小一致。構(gòu)建的pPICZαA-SjcTrx/TOP10 重組質(zhì)粒DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切和PCR擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠電泳中均觀察到相同大小基因片段，核苷酸序列測(cè)序證實(shí)SjcTrx基因序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致，長(zhǎng)度為318bp，開放閱讀框架編碼含有106個(gè)氨基酸，已登錄到GenBank (DQ401029)。SjcTrx與日本血吸蟲菲律賓株Trx和曼氏血吸蟲TrxDNA序列

9、同源性分別為98％(313/318)和70％(223/318)，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為96％(102/106)和64％(68/106)。重組表達(dá)載體pPICZαtA-SjcTrx/X-33經(jīng)限制性內(nèi)切酶單酶切、PCR擴(kuò)增和核苷酸序列測(cè)定均證實(shí)SjcTrx基因已整合于畢氏酵母菌染色體中。經(jīng)SDS-PAGE分析，在BMGY培養(yǎng)液中甲醇誘導(dǎo)可表達(dá)出SjcTrx重組蛋白，分子量約為14kDa，48～72h蛋白表達(dá)量最高。經(jīng)Ni<'2+>吸