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1、目的:檢測(cè)弓形蟲(Toxoplasma gondii, TG)Prugniaud株單獨(dú)或聯(lián)合卡介苗(BCG)作用后對(duì)小鼠惡性黑色素瘤的抑制作用效果,并嘗試從不同側(cè)面探討其作用機(jī)制,為篩選可能具有誘發(fā)非特異性免疫保護(hù)作用的組分提供新的線索。
方法:將綠色熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠GFP C57/B6接種B16細(xì)胞,建立荷瘤模型,將荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組,每組9只;兩天后,TG/BCG/B16組腹腔接種弓形蟲Prugniaud株(TG)和
2、卡介苗(BCG),TG/B16組接種Prugniaud株, BCG/B16組接種 BCG,B16組接種生理鹽水(NS),觀察抑瘤效應(yīng)。1、隔日測(cè)量腫瘤體積、三周后處死小鼠剝離腫瘤稱重、計(jì)算抑瘤率。2、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脾細(xì)胞體外與 B16細(xì)胞在不同效靶比下殺傷腫瘤活性。3、各同組小鼠血清分別與B16細(xì)胞體外作用36小時(shí)后,比較作用效果①DNA-Ladder實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;②HE染色鏡檢各組細(xì)胞形態(tài)。4、HE染色法對(duì)各組的腫瘤組織進(jìn)行病理形
3、態(tài)學(xué)對(duì)比觀察。5、免疫組化法檢測(cè)各組腫瘤血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)和微血管密度(MVD)。6、RT-PCR法檢測(cè)各組腫瘤組織VEGF mRNA的表達(dá)。7、流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率。
結(jié)果:1、B16、BCG/B16、TG/B16、TG/BCG/B16四組小鼠瘤重分別為(3.237±0.552)g、(2.461±0.320)g、(1.521±0.263)g、(1.069±0.444)g;各實(shí)驗(yàn)組抑瘤率分別為
4、:BCG/B16:23.95%、TG/B16:53.01%、TG/BCG/B16:66.98%,各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2、各組脾細(xì)胞殺傷活性隨著效靶細(xì)胞比的增加而增強(qiáng),在效靶比為50:1時(shí)下殺傷率達(dá)到最大,分別為 B16:(8.30±2.63)%、BCG/B16:(28.40±4.22)%、TG/B16:(44.80±2.99)%、TG/BCG/B16:(55.72±3.09)%,其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
5、3、不同組鼠血清體外和B16細(xì)胞作用后:①DNA-Ladder實(shí)驗(yàn),弓形蟲感染組TG/B16組和TG/BCG/B16組的DNA都出現(xiàn)了梯形狀條帶,而BCG/B16組和B16組則沒有;②HE染色鏡檢,感染組血清培養(yǎng)的細(xì)胞密度降低,細(xì)胞核出現(xiàn)濃染、核固縮。4、腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)觀察可見弓形蟲感染組有不同程度的腫瘤壞死區(qū)。5、免疫組化檢測(cè)小鼠腫瘤組織VEGF蛋白的表達(dá),四組表達(dá)量分別為B16:(79.67±5.43)%、BCG/B16:(68
6、.22±5.21)%、TG/B16:(41.89±4.94)%、TG/BCG/B16:(33.22±4.84)%,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。6、免疫組化法計(jì)數(shù)各組腫瘤組織 MVD, BCG/B16:(19.44±2.79)條、TG/B16:(10.78±2.86)條、TG/BCG/B16:(6.56±2.07)條,少于陰性對(duì)照組(23.56±4.13)條,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。7、RT-PCR法檢各組 VE
7、GF mRNA的相對(duì)表達(dá)量, VEGF120:B16(0.253±0.020)、BCG/B16(0.233±0.012)、TG/B16(0.167±0.011)、TG/BCG/B16(0.140±0.015)各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);VEGF164:B16(0.276±0.013)、BCG/B16(0.255±0.220)、TG/B16(0.190±0.015)、TG/BCG/B16(0.171±0.011)各組差異均
8、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。8、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組凋亡率 B16(7.37±1.30)%、B16/BCG(9.27±1.19)%、B16/TG(24.17±2.21)%、B16/TG/BCG(45.22±2.15)%。B16與 B16/BCG組比較無明顯差異,弓形蟲感染組(B16/TG組和B16/TG/BCG組)與B16組相比較凋亡率要高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論:1、弓形蟲Prugniaud株感染對(duì)小鼠體
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