弓形蟲Prugniaud株感染誘導(dǎo)小鼠抑制黑色素瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：檢測(cè)弓形蟲（Toxoplasma gondii, TG）Prugniaud株單獨(dú)或聯(lián)合卡介苗（BCG）作用后對(duì)小鼠惡性黑色素瘤的抑制作用效果，并嘗試從不同側(cè)面探討其作用機(jī)制，為篩選可能具有誘發(fā)非特異性免疫保護(hù)作用的組分提供新的線索。
　　方法：將綠色熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠GFP C57/B6接種B16細(xì)胞，建立荷瘤模型，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組，每組9只；兩天后，TG/BCG/B16組腹腔接種弓形蟲Prugniaud株（TG）和

2、卡介苗（BCG），TG/B16組接種Prugniaud株， BCG/B16組接種 BCG，B16組接種生理鹽水（NS），觀察抑瘤效應(yīng)。1、隔日測(cè)量腫瘤體積、三周后處死小鼠剝離腫瘤稱重、計(jì)算抑瘤率。2、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脾細(xì)胞體外與 B16細(xì)胞在不同效靶比下殺傷腫瘤活性。3、各同組小鼠血清分別與B16細(xì)胞體外作用36小時(shí)后，比較作用效果①DNA-Ladder實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；②HE染色鏡檢各組細(xì)胞形態(tài)。4、HE染色法對(duì)各組的腫瘤組織進(jìn)行病理形

3、態(tài)學(xué)對(duì)比觀察。5、免疫組化法檢測(cè)各組腫瘤血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)和微血管密度（MVD）。6、RT-PCR法檢測(cè)各組腫瘤組織VEGF mRNA的表達(dá)。7、流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)果：1、B16、BCG/B16、TG/B16、TG/BCG/B16四組小鼠瘤重分別為（3.237±0.552）g、（2.461±0.320）g、（1.521±0.263）g、（1.069±0.444）g；各實(shí)驗(yàn)組抑瘤率分別為

4、：BCG/B16：23.95％、TG/B16：53.01%、TG/BCG/B16：66.98%，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2、各組脾細(xì)胞殺傷活性隨著效靶細(xì)胞比的增加而增強(qiáng)，在效靶比為50:1時(shí)下殺傷率達(dá)到最大，分別為 B16：（8.30±2.63）%、BCG/B16：（28.40±4.22）%、TG/B16：（44.80±2.99）%、TG/BCG/B16：（55.72±3.09）%，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

5、3、不同組鼠血清體外和B16細(xì)胞作用后：①DNA-Ladder實(shí)驗(yàn)，弓形蟲感染組TG/B16組和TG/BCG/B16組的DNA都出現(xiàn)了梯形狀條帶，而BCG/B16組和B16組則沒有；②HE染色鏡檢，感染組血清培養(yǎng)的細(xì)胞密度降低，細(xì)胞核出現(xiàn)濃染、核固縮。4、腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)觀察可見弓形蟲感染組有不同程度的腫瘤壞死區(qū)。5、免疫組化檢測(cè)小鼠腫瘤組織VEGF蛋白的表達(dá)，四組表達(dá)量分別為B16：（79.67±5.43）%、BCG/B16：（68

6、.22±5.21）%、TG/B16：（41.89±4.94）%、TG/BCG/B16：（33.22±4.84）%，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。6、免疫組化法計(jì)數(shù)各組腫瘤組織 MVD， BCG/B16：(19.44±2.79)條、TG/B16：(10.78±2.86)條、TG/BCG/B16：(6.56±2.07)條，少于陰性對(duì)照組(23.56±4.13)條，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。7、RT-PCR法檢各組 VE

7、GF mRNA的相對(duì)表達(dá)量， VEGF120：B16（0.253±0.020）、BCG/B16（0.233±0.012）、TG/B16（0.167±0.011）、TG/BCG/B16（0.140±0.015）各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；VEGF164：B16（0.276±0.013）、BCG/B16（0.255±0.220）、TG/B16（0.190±0.015）、TG/BCG/B16（0.171±0.011）各組差異均

8、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。8、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組凋亡率 B16（7.37±1.30）%、B16/BCG（9.27±1.19）%、B16/TG（24.17±2.21）%、B16/TG/BCG（45.22±2.15）%。B16與 B16/BCG組比較無明顯差異，弓形蟲感染組（B16/TG組和B16/TG/BCG組）與B16組相比較凋亡率要高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：1、弓形蟲Prugniaud株感染對(duì)小鼠體