GM-CSF膜修飾小鼠黑色素瘤細(xì)胞疫苗的抑瘤實驗研究.pdf

1、黑色素瘤是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤，具有多種免疫逃逸機制，頑固性強，復(fù)發(fā)率高。目前，黑色素瘤的治療主要是以外科手術(shù)治療、放療和化療為主。大部分患者在確診時已發(fā)生癌轉(zhuǎn)移而無法實行根治切除，而手術(shù)后的放、化療一方面能殺死腫瘤細(xì)胞，另一方面卻對機體的免疫功能造成極大的損害，對提高腫瘤患者的生存率十分有限。腫瘤疫苗主要通過糾正腫瘤患者的免疫缺陷，啟動機體自身特異性抗腫瘤免疫反．應(yīng)，故已經(jīng)成為黑色素瘤綜合治療主要手段之一。 本研究

2、利用獨特的“錨定”生物技術(shù)，對小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16進行修飾，將GM-CSF迅速、穩(wěn)定地固定在細(xì)胞表面。這種GM-CSF膜修飾B16腫瘤細(xì)胞疫苗通過增強腫瘤細(xì)胞的免疫原性，直接激活免疫活性細(xì)胞，改善腫瘤局部微環(huán)境，可誘發(fā)機體的主動抗腫瘤免疫反應(yīng)(包括CD8介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng))，具有治療相應(yīng)腫瘤并抑制和預(yù)防其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的療效，無明顯的毒副作用。本研究包括三部分：第一部分GM-CSF膜修飾B16細(xì)胞疫苗的制備 目的：主要對GM-CSF

3、是否有效固定在B16細(xì)胞表面以及GM-CSF與B16細(xì)胞之間的修飾比例進行初步探索，優(yōu)化GM-CSF膜修飾B16細(xì)胞的制備參數(shù)，為膜修飾腫瘤細(xì)胞疫苗的應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。 方法：首先用一定濃度的細(xì)胞膜修飾劑(A液)處理不同量小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16)，將特定親和基團固定在細(xì)胞膜表面。含特異錨定配基的綠色熒光蛋白(GFP)與A液修飾后的B16細(xì)胞結(jié)合，確定最佳A液膜修飾B16細(xì)胞量。再用不同濃度的錨定GM-CSF液(B液)與A液膜修

4、飾后的B16細(xì)胞混合，通過A液的橋聯(lián)(錨定GM-CSF上所帶的配基與固定在細(xì)胞膜表面的特定基團相結(jié)合)將GM-CSF直接固定在B16細(xì)胞膜表面。FITC標(biāo)記的GM-CSF抗體與B液修飾后的細(xì)胞作用，流式細(xì)胞儀確定最佳B液修飾濃度。 結(jié)論：10<'7>個B16細(xì)胞經(jīng)2ml稀釋后的細(xì)胞膜修飾劑(A液)修飾后，再經(jīng)2m10.005mg/mL錨定GM-CSF液(B液)作用，GM-CSF在B16細(xì)胞表面達(dá)到最佳固定。經(jīng)A、B液修飾后的B1

5、6細(xì)胞重懸于2ml生理鹽水溶液，置于IOGy γ射線滅活，即可制成GM-CSF膜修飾的B16腫瘤疫苗，用于小鼠黑色素瘤B16的預(yù)防和治療。第二部分GM-CSF膜修飾B16細(xì)胞疫苗的預(yù)防性免疫保護作用 目的：研究GM-CSF膜修飾后的B16細(xì)胞疫苗接種小鼠后，能否激發(fā)體內(nèi)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，保護小鼠免受黑色素瘤細(xì)胞的攻擊。 方法：BLAB/C小鼠先接種GM-CSF膜修飾B16細(xì)胞疫苗，再接種B16細(xì)胞，建立預(yù)防組動物實驗

6、模型(Dayl，Day7接種瘤苗，Dayl4進行B16細(xì)胞攻擊)。MTT、檢測脾細(xì)胞增值，LDH檢測CTL活性，ELISA測定脾細(xì)胞IFN-γ分泌，同時觀察小鼠成瘤率，成瘤大小及存活時間。 結(jié)論：GM-CSF膜修飾B16細(xì)胞疫苗預(yù)防接種能完全保護實驗小鼠免受B16細(xì)胞攻擊；免疫小鼠的脾細(xì)胞CTL活性明顯提高；并能有效刺激脾淋巴細(xì)胞增殖和提高IFN-γ分泌水平，與其他免疫接種組相比差異顯著。 第三部分GM-CSF膜修飾B1

7、6細(xì)胞疫苗對荷瘤小鼠的抗腫瘤作用 目的：對B16細(xì)胞攻擊后的BALB/c小鼠進行GM-CSF膜修飾B16細(xì)胞疫苗接種治療，觀察GM-CSF膜修飾B16細(xì)胞疫苗治療后的荷瘤小鼠脾細(xì)胞增殖、CTL活性、IFN-γ分泌情況以及肝、肺組織癌轉(zhuǎn)移情況，初步分析GM-CSF膜修飾B16細(xì)胞疫苗對黑色素瘤的治療作用。 方法：BLAB/C小鼠先接種B16細(xì)胞，再接種GM-CSF膜修飾B16細(xì)胞疫苗，建立治療組動物實驗?zāi)Ｐ?Dayl接種B

8、16細(xì)胞，Day10，Dayl7，Day24接種瘤苗)。MTT檢測脾細(xì)胞增值，LDH檢測CTL活性，ELISA測定脾細(xì)胞IFN-γ分泌，HE染色觀察小鼠肝、肺及接種部位腫瘤組織的病理改變，同時觀察小鼠成瘤率、成瘤大小及存活時間。 結(jié)論：GM-CSF膜修飾B16細(xì)胞疫苗能抑制荷瘤小鼠腫瘤生長，提高CTL對B16腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，延長荷瘤小鼠存活時間，完全治愈率達(dá)到25％。但在未切除腫瘤組織的情況下采取瘤苗治療，腫瘤組織的存在會直