多西環(huán)素抑制惡性黑色素瘤小鼠移植瘤模型的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)惡性黑色素瘤小鼠移植瘤模型給藥實(shí)驗(yàn)，從病理形態(tài)學(xué)和分子水平研究多西環(huán)素對(duì)惡性黑色素瘤微循環(huán)模式和增殖活性的影響，初步闡明該藥對(duì)惡性黑色素瘤的作用及其機(jī)制，進(jìn)而為探索惡性黑色素瘤治療新途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：C57小鼠47只，隨機(jī)分為給藥組和對(duì)照組，鼠鼷部注射黑色素瘤B16細(xì)胞懸液建立荷瘤小鼠模型。待小鼠出現(xiàn)可觸及腫塊后開(kāi)始給藥，給藥組每日腹腔注射鹽酸多西環(huán)素，對(duì)照組給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥7天后處死給藥組和對(duì)照組小

2、鼠各10只。繼續(xù)給藥實(shí)驗(yàn)14天后處死剩余小鼠，剝離瘤塊并稱(chēng)重，取少量無(wú)壞死的新鮮腫瘤組織-80℃凍存。將剩余腫瘤組織沿最大面剖開(kāi)，常規(guī)固定并進(jìn)行HE和PAS染色，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。免疫組化染色觀察藥物對(duì)MMP-2、MMP-9、VEGF、PCNA表達(dá)的影響。計(jì)數(shù)方法如下：避開(kāi)壞死組織，選擇有代表性的10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，使用陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)整張切片的染色狀況。從凍存的新鮮腫瘤組織提取總蛋白，用明膠酶譜法檢測(cè)給藥組和

3、對(duì)照組腫瘤組織在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)中MMP-9、MMP-2酶原(pro-MMP-2)、活性MMP-2(actived-MMP-2)的活性變化，以觀察該藥對(duì)MMP-2、MMP-9活性的影響。腫瘤微循環(huán)模式計(jì)數(shù)方法如下：隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，結(jié)合PAS染色進(jìn)行內(nèi)皮依賴(lài)性血管、VM計(jì)數(shù)并取均值，觀察多西環(huán)素對(duì)腫瘤微循環(huán)的影響。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS進(jìn)行析因設(shè)計(jì)的方差分析比較各組間均數(shù)差異，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果：多西環(huán)素

4、給藥組小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度始終低于對(duì)照組，初期抑瘤效果比較顯著，但后期抑瘤作用有所降低，給藥7天抑瘤率為52.36％，給藥14天抑瘤率降為35.63％。明膠酶譜法分析顯示，給藥組的MMP-9和活性MMP-2的條帶酶解量以及活性MMP-2與MMP-2酶原比值均低于對(duì)照組(P＜0.01)，但兩組間MMP-2酶原條帶酶解量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，給藥7天后，給藥組的MMP-2、MMP-9表達(dá)均低于對(duì)照組(P＜0.01，

5、P＜0.05)；給藥組VEGF表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.05)；給藥組的內(nèi)皮依賴(lài)性血管和VM密度均低于對(duì)照組(P＜0.01，P＜0.05)。給藥14天后，給藥組MMP-2、MMP-9的表達(dá)均低于對(duì)照組(P＜0.01，P＜0.01)；給藥組VEGF表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.05)；給藥組的內(nèi)皮依賴(lài)性血管密度低于對(duì)照組(P＜0.01)，但兩組間血管生成擬態(tài)密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。另外，給藥7天后兩組間PCNA的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

6、(P＞0.05)，但給藥14天后給藥組PCNA的表達(dá)水平低于對(duì)照組(P＜0.05)。 結(jié)論：多西環(huán)素可以抑制惡性黑色素瘤小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制主要包括以下兩方面：(1)該藥可抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)和活性，在腫瘤發(fā)展早期階段該藥對(duì)黑色素瘤的內(nèi)皮依賴(lài)性血管和VM密度均有明顯的抑制作用，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用。但在腫瘤發(fā)展后期，該藥僅對(duì)內(nèi)皮依賴(lài)性血管有抑制作用，而對(duì)VM的抑制作用基本消失，抑瘤作用有所降低。其原因可能為

7、腫瘤發(fā)展后期缺氧壓力不斷增大促使腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)不依賴(lài)MMP-2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路形成VM；此外，具有胚胎樣基因表型的惡性黑色素瘤細(xì)胞在缺氧壓力增大時(shí)可能會(huì)提高自身的可塑性，提高VM形成能力，這在一定程度上抵消了多西環(huán)素對(duì)VM的抑制作用。本研究中腫瘤發(fā)展后期多西環(huán)素不能有效抑制VM而造成抑瘤作用降低的結(jié)論，在一定程度上解釋了目前單純靶向內(nèi)皮依賴(lài)性血管的抗血管生成療法效果不理想的原因。(2)該藥對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖周期的影響需要作用一定的時(shí)間才能顯現(xiàn)，