低氧條件下三氧化二砷通過細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)凋亡抑制肺癌細(xì)胞增殖.pdf

1、肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，也是發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤。在世界大多數(shù)國家，肺癌的患病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，尤其是發(fā)達(dá)國家，肺癌在男性常見的惡性腫瘤中居首位。盡管目前對于肺癌的診斷和治療方法較過去有了很大的提高，但中晚期肺癌患者的生存期仍無明顯延長。對常見化療藥物耐藥是導(dǎo)致晚期肺癌治療失敗的主要原因之一，而腫瘤局部組織低氧與肺癌細(xì)胞耐藥性的增加具有顯著的相關(guān)性。 局部組織低氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的特征之一，低氧使腫

2、瘤細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)的含量增加，進(jìn)而通過誘導(dǎo)一系列低氧適應(yīng)性基因的表達(dá)使腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境中仍具有強(qiáng)大的增殖能力。此外，低氧還可通過誘導(dǎo)多耐藥基因表達(dá)、降低細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積等機(jī)制使腫瘤細(xì)胞對化療藥物耐藥，導(dǎo)致許多傳統(tǒng)化療藥在低氧環(huán)境中療效下降。因此，發(fā)掘在低氧條件下對腫瘤細(xì)胞仍具有明顯殺傷作用的化療藥物具有重要的治療意義。 三氧化二砷(As2O3)是祖國醫(yī)學(xué)的傳統(tǒng)用藥，上世紀(jì)被我國學(xué)者首次用于治療早幼粒細(xì)胞白血病(A

3、PL)并取得較好療效，得到世界公認(rèn)。體外實(shí)驗(yàn)表明，As2O3對淋巴瘤、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤也有療效，并且As2O3在低氧條件下對白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤細(xì)胞仍有較強(qiáng)的殺傷作用。進(jìn)一步研究表明，As2O3對多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)凋亡，其中阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期特異性調(diào)控蛋白的表達(dá)是其啟動(dòng)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要作用機(jī)制之一。 基于以上研究現(xiàn)狀，我們提出這樣的問題：As2O3是否能夠在低氧條件下抑制肺癌細(xì)胞的增

4、殖?如果能夠，是通過何種機(jī)制抑制肺癌細(xì)胞增殖的?與這些問題相關(guān)的研究國內(nèi)外目前鮮有報(bào)道。本研究則對比觀察了As2O3在低氧(1％O2)及常氧(21％O2)條件下對人肺腺癌A549及A549/R細(xì)胞(耐藥細(xì)胞株，耐阿霉素、長春新堿等)的增殖及凋亡的影響，比較了As2O3與常規(guī)化療藥長春新堿(VCR)在低氧條件下對肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的差異，并就As2O3在常氧及低氧條件下對肺癌細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)展及細(xì)胞周期特異性調(diào)控蛋白表達(dá)的影響等問題做了進(jìn)

5、一步研究。 第一部分常氧及低氧條件下As2O3均通過誘導(dǎo)凋亡抑制肺癌細(xì)胞的增殖 本部分實(shí)驗(yàn)以人肺腺癌A549及A549/R細(xì)胞為研究模型，觀察不同濃度As2O3在常氧及低氧條件下對A549及A549/R細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討了低氧條件下VCR與As2O3對A549細(xì)胞毒性作用的差異。低氧條件由低氧發(fā)生袋獲取。首先分別在低氧及常氧條件下用不同濃度As2O3或VCR作用于A549和(或)A549/R細(xì)胞48 h，收集處

6、理后的細(xì)胞備用。其次，用MTT法檢測各組細(xì)胞經(jīng)As2O3或VCR處理后的細(xì)胞增殖抑制率(％)；對常氧及低氧條件下As2O3處理后的A549細(xì)胞進(jìn)行HIF-1α的Western blot檢測，以明確低氧條件的獲取是否客觀及As2O3對A549細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響。最后，為了明確As2O3及VCR在常氧及低氧條件下對肺癌細(xì)胞凋亡的影響，我們用流式細(xì)胞儀Annexin V-PI雙染色法檢測不同濃度As2O3或VCR作用于A549和(

7、或)A549/R細(xì)胞48 h后細(xì)胞的凋亡率(％)。 本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在A549細(xì)胞，當(dāng)As2O3濃度大于5μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率在常氧和低氧條件下均呈劑量依賴性增加，細(xì)胞早期凋亡率及總凋亡率在常氧和低氧條件下也均呈劑量依賴性增加，晚期凋亡率及死亡率與對照組相比無明顯改變；在A549/R細(xì)胞，當(dāng)As2O3濃度大于5μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率、早期凋亡率及總凋亡率在常氧及低氧條件下均呈劑量依賴性增加，晚期凋亡率及死亡

8、率與對照組相比無明顯改變；在常氧及低氧條件下，As2O3對A549/R的細(xì)胞毒作用較A549細(xì)胞均無明顯降低。在低氧條件下，As2O3對A549及A549/R.細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用較常氧條件均無明顯降低，而長春新堿在低氧條件下對A549細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用較常氧條件下則明顯減弱。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示常氧條件下細(xì)胞未表達(dá)HIF-1α蛋白，而低氧條件下細(xì)胞則大量表達(dá)HIF-1α[蛋白，但As2O3對細(xì)胞HIF-1

9、α僅蛋白的表達(dá)無明顯改變。 本部分實(shí)驗(yàn)表明：第一，As2O3在常氧及低氧條件下對A549細(xì)胞及耐藥的A549/R細(xì)胞均具有顯著的增殖抑制作用；第二，As2O3主要通過誘導(dǎo)凋亡抑制肺癌細(xì)胞的增殖，并且其細(xì)胞毒作用在低氧條件下無明顯減弱(與常氧條件相比)，而VCR在低氧條件下對肺癌細(xì)胞的殺傷作用則明顯減弱；第三，在本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞已充分適應(yīng)低氧環(huán)境。 第二部分常氧及低氧條件下As2O3通過G2/M期阻滯及下調(diào)survivin表達(dá)

10、誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡 本部分實(shí)驗(yàn)的目的在于探討As2O3誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。分別在常氧及低氧條件下用不同濃度的As2O3作用于A549細(xì)胞48 h，收集各組細(xì)胞備用。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的分布，半定量RT-PCR法檢測細(xì)胞Cyclin B1、CDC2及survivin mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測細(xì)胞Cyclin B1、CDC2、phospho-CDC2(Thr-161)及survivin蛋白

11、的水平。 本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在常氧及低氧條件下，As2O3均使A549細(xì)胞阻滯于G2/M期；As2O3均下調(diào)A549細(xì)胞Cyclin B1及survivin mRNA的表達(dá)，對CDC2mRNA的表達(dá)無顯著影響；As2O3均下調(diào)549細(xì)胞Cyclin B1、phospho-CDC2(Thr-161)及survivin蛋白的水平，對總CDC2蛋白的水平無顯著影響。根據(jù)這些結(jié)果我們認(rèn)為，在常氧及低氧條件下As2O3可通過G2/M期阻