三氧化二砷誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞株A-549凋亡和脹亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察三氧化二砷(As2O3)誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞株A-549細(xì)胞凋亡和脹亡并探討其機(jī)制及癌細(xì)胞凋亡和脹亡的初步界定。
　　 方法：選用人肺癌細(xì)胞株A-549,細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)法描寫(xiě)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制率、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定細(xì)胞周期(CC)、凋亡指數(shù)(AI)、細(xì)胞體積(CV)及脹亡指數(shù)(OI)，倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察A-549細(xì)胞經(jīng)不同濃度As2O3作用不同時(shí)間后的形態(tài)學(xué)變化，透射電鏡觀察細(xì)胞干預(yù)后的超微

2、結(jié)構(gòu)變化,激光共聚焦方法觀察干預(yù)后凋亡和脹亡細(xì)胞，Rh123和PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體跨膜電位(Δψm)，fluo-3染色、激光共聚焦顯微鏡觀察干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)游離鈣[Ca2+]I的變化，免疫組織化學(xué)(SABC)法分析As2O3對(duì)A-549細(xì)胞B淋巴細(xì)胞白血病2抗原(Bcl-2)及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等蛋白分子表達(dá)水平的影響，western blotting檢測(cè)干預(yù)后介導(dǎo)脹亡的膜特異性受體(Porimin)

3、的活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)干預(yù)后Caspase-3,Capase-9,Caspase-8蛋白水平的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：三氧化二砷可明顯抑制A-549細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖并且其抑制率有時(shí)-效和量-效關(guān)系。對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控：0.5、2.0μmol/L As2O3作用72小時(shí)后可使A-549細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，0.25、1.0、4.0μmol/L濃度組則表現(xiàn)為S期阻滯。對(duì)細(xì)胞凋亡和脹亡的影響：0.25、2.0μmol/L濃度組凋亡指數(shù)

4、(AI)出現(xiàn)兩個(gè)峰值(分別為13.05[％]，16.95％)；4.0μmol/LAs2O3作用72小時(shí)后，AI值下降到12.95％而OI達(dá)到18.94[％]；脹亡指數(shù)(OI)與As2O3有量-效性；光鏡下可見(jiàn)不同濃度下隨作用時(shí)間漸變的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；電鏡可觀察到2.0μmol/LAs2O3作用72小時(shí)后的凋亡細(xì)胞，及4.0μmol/LAs2O3作用72小時(shí)后的脹亡樣壞死細(xì)胞。共聚焦顯微鏡觀察到活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和脹亡細(xì)胞，其各組細(xì)胞比率與

5、凋亡指數(shù)和脹亡指數(shù)一致。誘導(dǎo)凋亡和脹亡的分子機(jī)制：As2O3能使A-549細(xì)胞線粒體跨膜電位下降和胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度增加，其變化幅度與As2O3有時(shí)-效和量-效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)組使Bcl-2、PCNA、AIF和porimin的表達(dá)均受到影響，4.0μmol/LAs2O3作用36小時(shí)后Bcl-2表達(dá)抑制率達(dá)最大值：4.0μmol/LAs2O3作用72小時(shí)后PCNA表達(dá)抑制率達(dá)最大值，AIF從線粒體釋放和porimin蛋白的水平上調(diào)均與As2O

6、3有時(shí)-效和量-效性。不同濃度As2O3作用A-549細(xì)胞株后均能激活Caspase通路：0.25μmol/L組主要依賴線粒體途徑；4.0μmol/L組主要死亡受體途徑；0.5～2.0μmol/L則兩種兼而有之。
　　 結(jié)論：As2O3能有效抑制人肺腺癌細(xì)胞株A-549的體外生長(zhǎng)和增殖并調(diào)控細(xì)胞周期，其抑制作用主要表現(xiàn)為凋亡和脹亡，其作用機(jī)制是激活了Caspase通路，其激活途徑隨作用濃度及時(shí)間不同而變化。推測(cè)0.25～2.0μ