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文檔簡介
1、茯苓是一種藥食兩用、大宗的常用中藥材,是高等真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,有茯苓與茯苓皮兩味藥材。三萜類化合物是其主要活性成分之一,具有抗腫瘤、抗氧化、抗驚厥等多種生物活性。茯苓通過甲羥戊酸途徑(MVA pathway)合成萜類骨架,并進(jìn)一步形成各種活性萜類物質(zhì)。5-磷酸甲羥戊酸激酶(phosphomevalonate kinase)是MVA途徑的第5個(gè)酶,其能催化5-磷酸甲羥戊酸(MVAP)形成5-焦
2、磷酸甲羥戊酸的反應(yīng)及其逆反應(yīng),是MVA到IPP途徑中的限速步驟;其基因表達(dá)量較低,且受下游產(chǎn)物的調(diào)節(jié),是整個(gè)萜類合成途徑中的重要調(diào)節(jié)位點(diǎn)之一。本研究克隆出茯苓磷酸甲羥戊酸激酶基因(PcPMK),通過酵母功能互補(bǔ)和體外酶促反應(yīng)驗(yàn)證基因功能,并進(jìn)行了相關(guān)酶動力學(xué)研究。主要研究結(jié)果如下:
1成功克隆PcPMK基因利用系列方法獲得具有完整ORF的茯苓磷酸甲羥戊酸激酶基因(PcPMK) mRNA序列1662bp,基因組DNA序列3249
3、bp;基因具有6個(gè)內(nèi)含子、7個(gè)外顯子,啟動子區(qū)具有ABA、生長素、MYB等多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)?;蚓幋a具有511個(gè)氨基酸,預(yù)測分子量54.8kDa的不穩(wěn)定疏水性蛋白PcPMK。PcPMK蛋白序列與真菌同源性較高,系統(tǒng)發(fā)育分析表明,蛋白的聚類結(jié)果與物種分類地位一致。蛋白具有與活性相關(guān)的P-loop等3個(gè)保守功能域,且這些功能域在模擬的PcPMK3D結(jié)構(gòu)上相鄰,具有典型GHMP家族蛋白的特征。
2 PcPMK基因能互補(bǔ)酵母ERG8基
4、因功能構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2-pcpmk,轉(zhuǎn)化至ERG8雜合突變型釀酒酵母菌株中。優(yōu)化產(chǎn)孢條件后,菌株在McClary培養(yǎng)基上25℃產(chǎn)孢培養(yǎng)15天,取細(xì)胞經(jīng)30mg/mL蝸牛酶30℃酶解約60min后,進(jìn)行四分體單孢分離,并利用營養(yǎng)表型和交配型PCR驗(yàn)證得到目的單倍體酵母菌株。目的菌株定量接種到5種不同的培養(yǎng)基上,進(jìn)行基因功能互補(bǔ)展示,得到預(yù)期互補(bǔ)結(jié)果,證明克隆得到的PcPMK基因具有PMK基因活性。
3重組PcPMK蛋白
5、具有5-磷酸甲羥戊酸激酶功能構(gòu)建原核表達(dá)載體pCold-pcpmk,并轉(zhuǎn)化至E.coli表達(dá)菌株BL21(DE3),優(yōu)化了蛋白表達(dá)條件,并利用優(yōu)化后的蛋白純化方法得到純化后PcPMK蛋白。利用原核表達(dá)純化的PcPMK蛋白、底物MVAP和ATP進(jìn)行體外酶促反應(yīng),UPLC-MS分析反應(yīng)產(chǎn)物中有目的產(chǎn)物5-焦磷酸甲羥戊酸和ADP的生成,證明表達(dá)的重組PcPMK蛋白具有ATP:5-磷酸甲羥戊酸磷酸轉(zhuǎn)移酶催化功能。
4 PcPMK是一種
6、Mn2+依賴型酶進(jìn)一步對PcPMK蛋白進(jìn)行酶動力學(xué)研究表明,PcPMK是一種Mn2+依賴型酶,Mg2+也能部分激活其活性。PcPMK酶對ATP的濃度敏感,高濃度ATP能抑制酶活性。利用丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶偶聯(lián)的微孔板連續(xù)監(jiān)測法測定PcPMK酶活性:對于底物ATP,酶的米氏常數(shù)Km為67.7±7.5μmol/L,最大反應(yīng)速率Vmax為6.21±0.19μmol/min/mg蛋白;對MVAP的Km為104.3±9.8μmol/L,Vmax
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