Livinα基因修飾樹突狀細胞體外激活細胞免疫的抗肺癌細胞系效應.pdf

1、第一部分:攜帶livinα基因的腺病毒感染DC制作腫瘤疫苗
　　[實驗背景]
　　凋亡抑制蛋白(Inhibitorofapoptosisprotein,IAP)家族成員能夠通過BIR結構域(baculovirusIAPrepeatsdomain,BIR)與促凋亡的半胱天冬酶(Caspase)結合,從而細胞抑制凋亡。Livin基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的IAP家族成員,它有兩種剪接異構體分別為Livinα和Livinβ。Livi

2、n在正常成人組織中含量甚微或不表達,而普遍過表達于原發(fā)性肺癌和其他惡性腫瘤組。腫瘤患者血清中存在Livin蛋白抗體,顯示人的免疫系統(tǒng)對Livin蛋白無免疫耐受。腺病毒載體具有高感染效率、高滴度、高表達、可感染分裂和不分裂的靶細胞等許多優(yōu)點。當重組腺病毒感染宿主細胞后,外源基因可持續(xù)表達2周以上,而不會整合到宿主細胞基因組中,保證宿主細胞相對安全。臍帶血作為來源豐富的造血干細胞,不易出現(xiàn)復制衰老和免疫衰老。甚至在人類白細胞抗原(human

3、leukocyteantigen,HLA)不匹配時,臍帶血移植也較少出現(xiàn)慢性或急性移植物抗宿主反應。利用攜帶Livinα基因的復制缺陷型重組腺病毒載體(recombinantadenovirus,rAd)感染臍帶血來源樹突狀細胞(dendriticcell,DC)制成疫苗,使得DC長程有效提呈腫瘤抗原成為可能。
　　[實驗目的]
　　1.構建攜帶人livinα基因的復制缺陷重組腺病毒(rAd-livinα);
　　2.

4、誘導培養(yǎng)健康人臍帶血來源的DC細胞;
　　3.rAd-livinα感染DC細胞制作成DC疫苗。
　　[實驗方法]
　　1.使用穿梭質粒pDC316-EGFP-livinα和骨架質粒pBHGlox_E1,3Cre共轉染293細胞,同源重組產(chǎn)生攜帶livinα基因的復制缺陷腺病毒rAd-livinα。rAd-livinα擴增純化后,對其鑒定并使用TCID50方法檢測滴度。
　　2.取健康胎兒臍帶血獲得單個核細胞,CD

5、34磁珠分選獲取前體DC。將細胞培養(yǎng)在含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)基中,并添加GM-CSF、SCF以及IL-4誘導DC成熟。
　　3.第5天根據(jù)細胞計數(shù),在MOI值200下加入rAd-livinα感染DC,第7天在細胞培養(yǎng)液中添加TNF-α促進DC細胞成熟。即得rAd-livinαDC疫苗。
　　[實驗結果]
　　1.rAd-livinα經(jīng)PCR擴增出符合預期大小的片段,證明rAd-livinα構建成功。病毒滴度為2

6、×109TCID50/毫升。
　　2.培養(yǎng)的成熟DC細胞呈現(xiàn)典型的顆粒增多,體積增大,突起變長的不規(guī)則形態(tài)。成熟DC細胞表面共刺激分子表達增多。
　　3.rAd或rAd-livinα感染DC細胞后,細胞可呈現(xiàn)綠色熒光。rAd-livinαDC即為腫瘤疫苗。
　　[結論]
　　通過同源重組產(chǎn)生攜帶livinα基因的復制缺陷腺病毒rAd-livinα。使用磁珠分選從嬰兒臍帶血單個核細胞中獲取前體DC。在多種細胞因子作

7、用下成功誘導前體DC分化、成熟。rAd-livinα感染DC細胞后即獲得rAd-livinαDC腫瘤疫苗。做好了為下一步應用研究的前期準備。
　　第二部分:rAd-livinαDC疫苗對肺癌細胞系的殺傷效率及作用機制
　　[實驗背景]
　　細胞免疫是機體殺傷腫瘤的最主要環(huán)節(jié),有理由認為Livin蛋白可作為抗原通過APC的MHCⅠ和MHCⅡ類分子提呈,從而活化特異性抗Livin的CD4+和CD8+T細胞。我們前期研究發(fā)現(xiàn)

8、通過構建攜帶人livinα基因修飾的小鼠DC疫苗能誘導出抗腫瘤特異性CTL,并產(chǎn)生有明顯作用的抗小鼠Lewis肺癌的效應。除了CTL外,在人的免疫系統(tǒng)中還存在一些非特異性的免疫細胞,如自然殺傷細胞(NKcells)、巨噬細胞等也能發(fā)揮抗瘤作用。因此本研究中,我們將對livinα基因修飾的臍帶血來源的DC疫苗激活臍帶血來源的效應細胞(主要成分為CTL)對肺癌細胞系的殺傷效率進行探討。除研究抗livin特異性T淋巴細胞的抗腫瘤作用外,本實驗

9、還觀察在DC疫苗發(fā)揮作用過程中淋巴細胞向各個亞群分化的情況,以及特異性抗livinT淋巴細胞數(shù)量變化,從而進一深入探索rAd-αDC疫苗對肺癌細胞系的殺可能的傷作用機制。
　　[實驗目的]
　　1.證實rAd-livinαDC疫苗表達livinα蛋白;
　　2.評估rAd-livinαDC疫苗激活的效應細胞對Livin相關腫瘤細胞的殺傷效率,研究這種殺傷效率是否具有特異性;
　　3.研究rAd-livinαDC疫

10、苗對T淋巴細胞亞群分化的影響,以及抗livin特異性T淋巴細胞的測定。
　　[實驗方法]
　　1.Westernblot方法檢測A549、H460、HBE、rAd-cDC、rAd-livinαDC和單個核細胞Livin蛋白表達;
　　2.以CFSE標記腫瘤細胞,與激活的效應細胞按比例混合,相互作用后使用AnnexinⅤ/PI染料通過流式細胞學檢測靶細胞凋亡;
　　3.通過RT-PCR方法檢測四組T淋巴細胞亞群相應

11、的特異性核轉錄因子T-bet,GATA3,FOXP3和RORC從而檢測T細胞向Th1、Th2、Treg和Th17亞群,分化;流式細胞學檢測抗Livin特異性T細胞:Th1(CD4+IFN-γ+Tcell)、Tc1(CD8+IFN-γ+Tcell)、Th2(CD4+IL-4+Tcell)和Tc2(CD8+IL-4+Tcell)。
　　[實驗結果]
　　1.livin蛋白表達于A549、H460腫瘤細胞系和rAd-livinα感

12、染后的DC細胞,不表達于HBE細胞系和臍帶血單個核細胞。
　　2.rAd感染DC細胞后,可促進DC細胞成熟和分化,增強DC細胞功能。rAd感染的DC細胞誘導T細胞向Th1細胞分化,rAd-livinα感染的DC細胞除誘導Th1細胞增多外,特異性Tc1淋巴細胞較對照組顯著增多。
　　3.rAd-hlivinαDC能增強腫瘤特異性CTL細胞毒作用,而較少出現(xiàn)自身免疫反應。
　　[結論]
　　利用攜帶livinα基因的