當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物對過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景：
　　 心血管疾病在我國的發(fā)病率逐年增加，目前已經(jīng)成為造成我國人民死亡的首要疾病。近年來的大量研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是多種心血管疾病如心力衰竭、擴(kuò)張性心肌病(DCM)、阿霉素誘導(dǎo)性心肌病和病毒性心肌炎、心肌梗塞、心肌缺血等的一個(gè)重要的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制。同時(shí)細(xì)胞凋亡參與心室重構(gòu)和心功能不全的發(fā)生，是心功能遠(yuǎn)期預(yù)后的重要預(yù)報(bào)因子。
　　 缺氧、缺氧復(fù)氧、酸中毒、氧化應(yīng)激、壓力應(yīng)激等多種刺激均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。其

2、中，氧自由基代謝障礙是心肌細(xì)胞凋亡的重要促發(fā)因素，生物體內(nèi)存在的活性氧可以與DNA、蛋白質(zhì)、多元不飽和脂肪酸等作用，造成DNA鏈斷裂、突變和對熱穩(wěn)定性的改變，嚴(yán)重影響遺傳信息的傳遞，使細(xì)胞代謝功能紊亂；導(dǎo)致蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)交聯(lián)、蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)，使其理化性質(zhì)和生物學(xué)功能發(fā)生改變；作用于生物膜的多不飽和脂肪酸，使其發(fā)生脂質(zhì)過氧化[6]，造成膜的完整性被破壞、膜流動性下降、膜脆性增加，影響細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)與信息的交換。當(dāng)活性氧過氧化氫(H2O2

3、)高濃度作用于心肌細(xì)胞時(shí)，可致細(xì)胞內(nèi)活性氧水平迅速增加，并誘導(dǎo)體內(nèi)抗氧化劑如：超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱苷肽過氧化物酶等的活性降低，使生物膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整性遭到破壞，致使細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡(PCD)，是多細(xì)胞有機(jī)體為保持自身組織穩(wěn)定、調(diào)控自身細(xì)胞的增殖和死亡之間的平衡、由基因控制的細(xì)胞主動性死亡過程。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素很多，體內(nèi)代謝或外源性因素產(chǎn)生的自由基均被證實(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.在細(xì)胞凋亡的發(fā)

4、生機(jī)制研究中，已知的引起細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)通路有：死亡因子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；p53+基因觸發(fā)的細(xì)胞凋亡；線粒體損傷啟動的細(xì)胞凋亡。通過以上通路，細(xì)胞凋亡的結(jié)果使體細(xì)胞特別是具自重要功能的細(xì)胞如腦細(xì)胞、心肌細(xì)胞數(shù)量減少，造成其組成的重要器官如心室肌等發(fā)生衰退性病理過程。在心肌細(xì)胞凋亡中研究較多的有兩條主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即線粒體通路和膜死亡受體通路。
　　 通過干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡能在一定程度上保護(hù)心肌細(xì)胞，因此

5、，人們在研究藥物對心肌細(xì)胞凋亡影響方面產(chǎn)生了濃厚的興趣。長期以來，中藥在心血管疾病的治療中占據(jù)了一定的地位。目前，中藥與心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)性的研究正受到普遍關(guān)注，并取得了一些可喜的成果，其研究正在不斷深入，尤其在探索中藥有效單體成分對心肌細(xì)胞凋亡的影響方面。
　　 本實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用超濾膜技術(shù)對傳統(tǒng)方劑當(dāng)歸補(bǔ)血湯進(jìn)行分離純化，前期研究已證實(shí)，當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物具有清除氧自由基，抗脂質(zhì)過氧化，抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。在本課題中，通過模擬體

6、內(nèi)心肌細(xì)胞氧化損傷過程，建立H2O2誘導(dǎo)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞凋亡模型，觀察當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物對氧化損傷誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞凋亡的影響，從而為明確當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物抗凋亡的作用機(jī)制及其臨床應(yīng)用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 1、運(yùn)用超濾膜技術(shù)對中藥合劑進(jìn)行分離、純化。
　　 2、研究當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物抗心肌細(xì)胞氧化損傷的作用。
　　 3、研究當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。
　　

7、4、研究當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物對氧應(yīng)激狀態(tài)下心肌細(xì)胞熱休克蛋白70表達(dá)的影響。
　　 5、為當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、應(yīng)用陶瓷膜微濾和聚丙烯腈(PAN)中空纖維超濾膜(截留分子量為10萬分子量)精制當(dāng)歸、紅芪合劑(1∶5)水提物。
　　 2、Wistar乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)：取出生后1～3d的大鼠乳鼠，用75％乙醇溶液浸泡消毒皮膚后，移入超凈工作臺。開胸取出心室肌

8、，運(yùn)用酶消化法反復(fù)多次消化，收集細(xì)胞懸液，以差速貼壁法分離純化心肌細(xì)胞，用含15％小牛血清的DF培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升5×105，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。選生長狀態(tài)佳者于72 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用臺盼藍(lán)染色法檢測心肌細(xì)胞存活率。采用心肌細(xì)胞α橫紋肌肌動蛋白(α-Sarcomericactin)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法鑒定心肌細(xì)胞純度。
　　 3、制備乳鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷模型：以400μmol·L-1的H2O2誘導(dǎo)心

9、肌細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)分為以下5組：正常對照組；H2O2模型組(作用6h)；當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物高劑量干預(yù)組(15 g·L-1)、當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物中劑量(7.5 g·L-1)干預(yù)組、當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物低劑量(3.75 g·L-1)干預(yù)組。倒置相差顯微鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：MTT法檢測心肌細(xì)胞細(xì)胞活力改變；Annexin V-FITC/PI雙染法標(biāo)記凋亡心肌細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。
　　 4、應(yīng)用半定量逆

10、轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)和蛋白印(Western-blotting)技術(shù)測定凋亡相關(guān)基因蛋白Hsp70、Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)。
　　 5、用生化學(xué)技術(shù)檢測氧化應(yīng)激狀態(tài)下心肌細(xì)胞相關(guān)酶類如SOD、LDH、CK、MDA、MPO的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定，10萬分子量當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物多糖含量接近單劑含量，當(dāng)歸多糖含量為23.84 g·L-1，紅芪多糖含

11、量為27.55 g·L-1，合劑多糖含量為22.08g·L-1。
　　 2、倒置相差光學(xué)顯微鏡下觀察：正常心肌細(xì)胞伸出偽足互相融合成片，細(xì)胞核折光性好，搏動具有整體性、協(xié)調(diào)性和規(guī)律性。H2O2損傷組細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核暗淡，搏動明顯減弱，部分停搏，搏動幅度強(qiáng)弱不一，搏動頻率與正常對照組相比較差異具有顯著性。當(dāng)歸紅芪超濾物高、中、低劑量干預(yù)組心肌細(xì)胞搏動頻率分別為86.9±8.4、71.1±6.7和43.7±9.6次/min，細(xì)胞偽足

12、較對照組變細(xì)，搏動頻率略減低，但高于氧化損傷組。
　　 3、MTT法檢測心肌細(xì)胞的存活率：氧化損傷模型組心肌細(xì)胞嚴(yán)重受損，細(xì)胞存活率顯著降低，與正常對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)歸紅芪超濾物干預(yù)組心肌細(xì)胞的受損顯著改善，存活率顯著提高，高、中、低劑量組分別為77.6％、64.40％、43.9％，與氧化損傷組比較差異顯著。
　　 4、生化學(xué)檢測：H2O2處理使細(xì)胞膜的通透性增加，培養(yǎng)介質(zhì)中LDH、CK的含量增加，與正常對照組

13、比較。當(dāng)歸紅芪超濾物可顯著抑制H2O2所致心肌細(xì)胞膜通透性的改變，高劑量組、中劑量組、低劑量組均能減少LDH、CK的外漏，與模型組比較差異顯著。H2O2損傷組細(xì)胞內(nèi)MDA、MPO含量增加、SOD活力降低，與正常對照組(MDA2.34±0.50 nmol/mL，MPO38.47±1.12 U/L，SOD118.33±5.77U/mL)比較，差異顯著。當(dāng)歸紅芪超濾物可顯著降低心肌細(xì)胞內(nèi)MDA、MPO的含量，提高SOD活力，高劑量組、中劑量組

14、、低劑量組與模型組比較均具有顯著性差異；且呈劑量依賴關(guān)系，隨超濾物濃度的增加LDH、CK、MDA、MPO含量逐漸減少，SOD活力逐漸增加。
　　 5、RT-PCR檢測結(jié)果：正常對照組Hsp70、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA呈低水平表達(dá)，模型組Hsp70、Caspase-3、Bax mRNA表達(dá)量顯著增加，Bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著降低，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，各超濾物干預(yù)組Hsp7

15、0 mRNA呈過度表達(dá)，Bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著增加，而Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、Western-blotting檢測結(jié)果：400μmol·L-1 H2O2處理心肌細(xì)胞6h后，模型組心肌細(xì)胞中Hsp70、Bax蛋白的表達(dá)明顯增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯降低，與正常對照組比較差異具有顯著性，Bcl-2/Bax的蛋白比值降低。而經(jīng)當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物處理后，心肌細(xì)胞中H

16、sp70蛋白表達(dá)量均較模型組顯著增加；在高劑量組和中劑量組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加，Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2/Bax比值顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低劑量組則Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)無顯著改變。
　　 結(jié)論：
　　 1、氧化損傷是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的重要原因之一。
　　 2、當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物具有抗過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的作用，可減輕細(xì)胞活力的下降，抑制心肌細(xì)胞凋亡。
　　 3、B