激動(dòng)核受體RXR對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、凋亡，即細(xì)胞程序性死亡，是某些組織器官病理性重構(gòu)的重要機(jī)制之一，如心衰、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓。同時(shí)在心梗急性期、開(kāi)胸手術(shù)心臟停頓、心臟移植過(guò)程中出現(xiàn)大量心肌細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激是細(xì)胞凋亡的重要原因之一，也是血管和心肌細(xì)胞損害的重要原因。過(guò)氧化氫是細(xì)胞凋亡研究中應(yīng)用范圍最廣的氧化劑之一，目前，很多文獻(xiàn)報(bào)道了用過(guò)氧化氫誘導(dǎo)包括原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞株H9c2在內(nèi)的眾多細(xì)胞發(fā)生凋亡，建立細(xì)胞損傷模型。 維生素A及其衍生物類(lèi)視黃醇，

2、在細(xì)胞增殖、分化、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及各種代謝中發(fā)揮重要作用。包括維甲酸在內(nèi)的類(lèi)視黃醇生物活性作用是通過(guò)激動(dòng)核受體視黃酸受體（RAR）、維甲酸X受體（RXR）介導(dǎo)的。RXR可以和很多其它核受體形成異二聚體，如肝X受體(LXR)、過(guò)氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)、RAR，這使得RXR成為核受體中頗為獨(dú)特的一員。維甲酸信號(hào)通路在心臟發(fā)育和生理性形態(tài)形成中有著非常重要的作用，因?yàn)镽XRα敲除胎鼠(RXRα-/-)在胚胎發(fā)育的中期就死亡，主要

3、原因?yàn)樾呐K發(fā)育異常，表現(xiàn)為心臟致密帶發(fā)育不良，室間隔缺損。但RXR在心肌細(xì)胞氧化損傷中的作用目前還未見(jiàn)報(bào)道。為此，我們采用過(guò)氧化氫建立心肌細(xì)胞凋亡模型，用RXR激動(dòng)劑9順式維甲酸、RXR拮抗劑HX531干預(yù)，探討核受體RXR在心肌細(xì)胞抗氧化損傷中的作用及其機(jī)制。內(nèi)容包括： 第一部分：激動(dòng)核受體RXR對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞株H9c2凋亡影響的研究 實(shí)驗(yàn)一：過(guò)氧化氫通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡 為了探討氧化應(yīng)激誘

4、導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡通路，我們用100 μmol/L過(guò)氧化氫(H2O2)刺激大鼠心肌細(xì)胞H9c2，誘導(dǎo)其凋亡。用MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞活力，Hoechst 33258染色觀察晚期凋亡，流式法檢測(cè)凋亡比例，JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位，Nuc ViewTM488 Caspase-3試劑盒檢測(cè)Caspase-3活力。二氫乙啶探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H9c2細(xì)胞在100 μmol/L H2O2處理后，細(xì)胞活力明顯降低，與線粒體凋亡通路相

5、關(guān)的現(xiàn)象相繼出現(xiàn)，如線粒體膜電位（△Ψm）降低，Caspase-3活力增強(qiáng)。二氫乙啶探針顯示在H2O2處理后，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯增高。結(jié)論：氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡是通過(guò)線粒體積累產(chǎn)生活性氧而激活線粒體凋亡通路實(shí)現(xiàn)的。 實(shí)驗(yàn)二：激動(dòng)核受體RXR可以抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡 核受體RXR在心肌細(xì)胞發(fā)育中有著至關(guān)重要的作用，但在心肌細(xì)胞凋亡中的作用目前還未見(jiàn)報(bào)道，我們用RXR激動(dòng)劑9順式維甲酸，RX

6、R拮抗劑HX531探討RXR在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用。我們用MTT檢測(cè)心肌細(xì)胞活力，檢測(cè)乳酸脫氫酶釋放率反映細(xì)胞膜損害，Hoechst 33258檢測(cè)細(xì)胞晚期凋亡比率，流式法檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡比率和Caspase 3活力，JC-1試劑檢測(cè)細(xì)胞線粒體細(xì)胞膜電位，二氫乙啶探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。與單獨(dú)H2O2處理組相比，9順式維甲酸預(yù)處理組細(xì)胞凋亡明顯減少，而這種保護(hù)作用可以被HX531阻斷；同時(shí)9順式維甲酸能穩(wěn)定線粒體膜電位，

7、減少細(xì)胞活性氧水平。H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡不伴有核受體RXR、Nur77出核。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，激動(dòng)核受體RXR可以抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，可能與穩(wěn)定線粒體膜電位和減少活性氧有關(guān)，而與是否抑制Nur77/RXR異二聚體出核無(wú)關(guān)。 第二部分：激動(dòng)核受體RXR對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞凋亡影響的研究 實(shí)驗(yàn)三：新生大鼠心肌細(xì)胞體外原代培養(yǎng)與鑒定 采用胰蛋白酶冷消化法與機(jī)械分離法相結(jié)合獲得新生大鼠心肌細(xì)胞，應(yīng)用

8、差速貼壁法和化學(xué)抑制法純化，0.4％臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)細(xì)胞存活率，用抗橫紋肌細(xì)胞特異性肌動(dòng)蛋白抗體行免疫熒光鑒定。本試驗(yàn)還比較了胰蛋白酶冷消化法與溫消化法，比較細(xì)胞純化方法，討論細(xì)胞爬片方法，消化液、動(dòng)物的選擇。結(jié)果：改良方法培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞，細(xì)胞存活率達(dá)90％，12 h后即可觀察到部分心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)，24 h后心肌細(xì)胞已全部貼壁，大部分搏動(dòng)，72 h后細(xì)胞成簇同步搏動(dòng)，搏動(dòng)可維持20 d以上。免疫組化鑒定細(xì)胞純度達(dá)95％以上。

9、 實(shí)驗(yàn)四：RXR受體激動(dòng)劑9-順式維甲酸抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞凋亡 我們前期研究顯示激動(dòng)核受體RXR在心肌細(xì)胞株H9c2中的抗凋亡作用，但細(xì)胞株不具有原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征，故我們繼續(xù)探討RXR受體激動(dòng)劑9-順式維甲酸在H2O2誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞凋亡中作用及其機(jī)制。我們以培養(yǎng)的新生Sprague-Dawley（SD)大鼠心肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組(N組)、100 μmol/L H2O2刺激組(H

10、組),和100 nmol/L 9-cis RA干預(yù)組(H+R組)。應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，以Hoechst 33258熒光染色觀察凋亡細(xì)胞，流式法檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率，JC-1熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位（△Ψm）變化，CM-H2DCFDA熒光探針測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果顯示9-cis RA明顯增強(qiáng)H2O2刺激后的心肌細(xì)胞活力，減少凋亡比例，穩(wěn)定線粒體膜電位，減輕細(xì)胞活性氧產(chǎn)生。 結(jié)論：RXR受體激動(dòng)劑9-cis RA能夠部分抑制H2

11、O2誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。 研究表明，過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是通過(guò)促使線粒體積累產(chǎn)生活性氧而激活線粒體凋亡通路實(shí)現(xiàn)的。核受體RXR激動(dòng)劑9-cis RA可以部分抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞（包括心肌細(xì)胞株H9c2和原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞）壞死和凋亡，而這種保護(hù)作用可以被RXR拮抗劑HX531所阻斷；其機(jī)制可能與激動(dòng)RXR可以穩(wěn)定線粒體膜電位、減少活性氧產(chǎn)生有關(guān)，而與是否抑制Nur77/RXR