與幽門螺桿菌CagA相互作用的胃黏膜蛋白篩選及二者相互作用的功能研究.pdf

1、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp），全球約一半人口感染，我國人群感染率更是高居不下。Hp感染與人類慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和黏膜相關淋巴組織淋巴瘤（MALT）的發(fā)生密切相關。該菌已被明確列為人類胃癌發(fā)生的I類致癌原。而該菌產生的細胞毒素相關蛋白（cytotoxin associated antigen A，CagA），是已知最重要的毒素之一，被認為是一種細菌性致癌蛋白，成為該領域研究的焦點。已有研究發(fā)現(xiàn)

2、CagA在宿主細胞內可與20余種蛋白相結合，促發(fā)一系列細胞信號轉導通路的激活，參與調控生長、運動，引起細胞骨架重排，誘導炎癥因子釋放等，與胃癌密切相關。
　　鑒于雖然已發(fā)現(xiàn)了多種的CagA結合蛋白，但 CagA的致癌機理仍未完全闡明，因此很可能還存在一些目前未知的能與 CagA蛋白相互作用的細胞蛋白。為了更深入研究 CagA的致癌機制，本研究利用酵母雙雜交方法篩選與 CagA蛋白相互作用的胃黏膜細胞蛋白，并進一步在體內外確定 Ca

3、gA蛋白可與該篩查候選蛋白發(fā)生相互作用，最后探討 CagA與候選蛋白相互作用在 CagA致病機制中的影響。
　　本研究第一部分通過酵母雙雜交方法篩選與 CagA蛋白發(fā)生相互作用的胃黏膜細胞蛋白。為此，首先，構建用于酵母雙雜交的pGBKT7-cagA誘餌載體，并證實其在酵母中可表達 BD-CagA融合蛋白，進一步采用濾紙法定性和液相分析法定量檢測證實 CagA蛋白在酵母細胞內不具有反式激活 GAL4的功能。而后，從臨床標本中提取人胃

4、黏膜總 RNA，逆轉錄、純化獲取 ds cDNA，并將其與線性質粒 pGADT7-Rec共轉化酵母細胞，構建獲得達到酵母雙雜交文庫要求的人胃黏膜cDNA文庫。最后，應用酵母雙雜交技術篩選人胃黏膜 cDNA文庫，共得到4種與 CagA相互作用的胃黏膜細胞蛋白，即：PGA3、eEF1A1、YWHAE和β-Actin。
　　在對上述4種蛋白功能分析的基礎上，本研究的第二部分選擇YWHAE蛋白進行進一步研究，旨在探討 CagA與 YWHA

5、E的相互作用對 CagA致病作用的影響。為此，首先，依次通過一對一酵母雙雜交回復驗證實驗，GST-pull down體外沉淀技術和免疫共沉淀實驗，分別證實 CagA可以和YWHAE在酵母細胞內、體外和哺乳動物細胞內發(fā)生直接相互作用。而后，通過共轉染 pCMVTNT-cagA和pCMVTNT-YWHAE或 YWHAE siRNA，利用螢火蟲熒光素酶報告實驗表明 CagA可通過與 YWHAE相互作用激活細胞 NF-κB，利用細胞上清 ELI