蜈蚣不同部分提取液對肝癌細(xì)胞Bel-7404移植瘤的抑制作用及毒理學(xué)研究.pdf

1、本課題前期研究表明全蟲蜈蚣提取液(Extract of centipedes，ECP)對肝細(xì)胞肝癌(HCC)有一定的治療作用，并對其治療肝細(xì)胞肝癌的機(jī)制作了初步的探討。我們在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討蜈蚣頭足部分、全蟲部分、軀干部分提取液對實(shí)驗(yàn)性肝癌的抑制作用，并對蜈蚣不同部分提取液(Extract from different parts of Centipedes，ECPs)進(jìn)行系統(tǒng)的毒理研究，通過觀察ECPs的毒理學(xué)反應(yīng)，以期確定ECP

2、s的毒性大小、毒性作用的靶器官，以及探討ECPs對肝臟毒性作用的機(jī)制，為臨床合理選擇用藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第一章蜈蚣不同部分提取液對肝癌細(xì)胞Bel-7404移植瘤的抑制作用
　　 目的:研究ECPs在體內(nèi)對肝癌細(xì)胞Bel-7404移植瘤的抑制作用。
　　 方法:建立裸鼠Bel-7404人異位肝癌移植模型，以ECPs予以灌服，觀察腫瘤生長及肝癌轉(zhuǎn)移情況。
　　 結(jié)果:①裸鼠Bel-7404人異位肝癌移植

3、模型成功率100％;②ECPs對裸鼠Bel-7404移植瘤有明顯抑制作用，移植瘤術(shù)后30天，荷瘤對照組腫瘤體積為1000.5±87.4 mm3，而頭足組、全蟲組、軀干組腫瘤體積分別為:460.3±61.7、526.1±75.7、530.7±81.3 mm3。移植瘤重量荷瘤對照組為1120.01±101.94mg，而頭足組、全蟲組、軀干組腫瘤分別為593.73±37.01、659.57±62.88、669.42±45.00mg，對照組與治

4、療組間均有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，計算頭足組、全蟲組、軀干組腫瘤抑制率分別達(dá)到46.99％、41.11％、40.23％。頭足組、全蟲組、軀干組組間比較，全蟲組與軀干組平均腫瘤重量較為接近，無顯著性差異;而頭足組平均腫瘤重量低于全蟲組與軀干組，有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:①成功建立人肝癌Bel-7404細(xì)胞株裸鼠移植瘤動物模型;②ECPs以10g生藥/kg的劑量給藥時，有抑制裸鼠Bel-7404移植瘤的作用

5、，其中頭足提取液抑瘤作用更顯著。
　　 第二章蜈蚣不同部分提取液的毒性研究
　　 目的:通過急性毒性試驗(yàn)和長期毒性試驗(yàn)評價ECPs的一般毒性作用;通過體內(nèi)微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)評價ECPs的遺傳毒性作用。
　　 方法:
　　 (1)急性毒性試驗(yàn):用不同劑量ECPs灌胃昆明小鼠，觀察小鼠活動、毒性反應(yīng)及死亡情況。
　　 (2)長期毒性試驗(yàn):用不同劑量ECPs灌胃SD大鼠，觀察動物的反應(yīng)

6、及體重變化，分別于第4周和第13周取血作血常規(guī)及生化檢查及行病理解剖，檢查主要臟器的病理變化及計算臟器系數(shù)。留下的動物停藥后繼續(xù)觀察2周（第15周）后再活殺，了解毒性反應(yīng)的恢復(fù)情況和可能出現(xiàn)的延遲性毒性。
　　 (3)遺傳毒性試驗(yàn):①微核試驗(yàn):用不同劑量ECPs灌胃昆明小鼠。給藥后取股骨骨髓細(xì)胞制作涂片，觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，以微核率表示。②精子畸變試驗(yàn):用不同劑量ECPs灌胃昆明小鼠。給藥后附睪濾液制作涂片，觀察畸形精

7、子數(shù)，計算其畸變率。③AMES試驗(yàn):采用標(biāo)準(zhǔn)平板法，計數(shù)每皿上長出的回變菌落數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)急性毒性試驗(yàn):頭足組的LD50為39.18g生藥/kg，95％平均可信區(qū)間32.89～45.019生藥/kg;全蟲組的LD50為51.209生藥/kg，95％平均可信區(qū)間41.81～59.97g生藥/kg，軀干組LD50為53.85g生藥/kg，95％平均可信區(qū)間45.09～62.12g生藥/kg。
　　

8、(2)長期毒性試驗(yàn):①一般生理指標(biāo):實(shí)驗(yàn)初期ECPs可引起部分動物嘔吐和大便性狀改變，隨后可緩解。實(shí)驗(yàn)過程中，與同期對照組相比，ECPs對SD大鼠攝食量無明顯影響;ECPs可引起頭足高劑量組大鼠體重增長減慢。②血液學(xué)指標(biāo):給藥期間（第4周，第13周），與同期對照組相比，ECPs可引起RBC、HB降低，ALT、AST增高，BUN、CREA增高，PT、TT、APTT延長，并且有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05);到恢復(fù)期結(jié)束，除頭足高

9、劑量組ALT、AST外，其它指標(biāo)基本恢復(fù)正常。同時期同處理組不同劑量水平組內(nèi)比較:高、低劑量之間，以上指標(biāo)存在統(tǒng)計學(xué)差異。同時期同劑量水平不同處理組組間比較:低劑量時，各組間以上指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異;高劑量時，頭足組與全蟲組、頭足組與軀干組比較， ALT、AST、BUN、CREA、PT、APTT存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01，P＜0.05)，而全蟲組與軀干組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。③病理檢查:處死大鼠行病理學(xué)檢查，各組對臟器系數(shù)無

10、明顯影響。給藥期間，頭足中高劑量組、全蟲高劑量組、軀干高劑量組可引起肝細(xì)胞腫脹改變，頭足高劑量組甚至導(dǎo)致肝臟壞死改變，還可引起腎臟輕度水變性改變。停藥后2周，肝腎損害程度減輕，腎臟基本恢復(fù)正常，部分肝臟遺留壞死改變。各組對心臟、腦、肺臟、脾臟組織無明顯損害。
　　 (3)遺傳毒性試驗(yàn):①微核試驗(yàn):蜈蚣提取液各劑量組微核率與陰性對照組之間無顯著性差異（P＞0.05），而環(huán)磷酰胺陽性對照組與陰性對照組間有顯著性差異(P＜0.01)，

11、說明該蜈蚣提取液無致小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核增生作用。②精子畸形試驗(yàn):蜈蚣提取液對大鼠精子畸形發(fā)生率無明顯影響，各劑量組與陰性對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)，而陽性對照組與陰性對照組有顯著性差異（P＜0.01），說明蜈蚣提取液無致小鼠精子畸形作用。③Ames試驗(yàn):陽性對照組的回變菌落數(shù)超過自發(fā)回變對照組菌落數(shù)的2倍，而蜈蚣提取液各劑量組的回變菌落數(shù)均末超過自發(fā)回變菌對照組落數(shù)的2倍，結(jié)果為陰性。
　　 結(jié)論:①中藥蜈蚣頭

12、足部分提取液為小毒，全蟲部分、軀干部分提取液毒性接近，毒性更小。②相同劑量下，中藥蜈蚣不同提取液的毒性大小依次為:頭足部分＞全蟲部分≥軀干部分。③ECPs可引起肝腎損害和凝血功能異常，肝臟、腎臟、血液系統(tǒng)可能為主要的毒性靶器官，其中肝臟損害較重，而腎臟和血液系統(tǒng)損害相對較輕。④ECPs在本實(shí)驗(yàn)條件下無明顯遺傳毒性作用。⑤臨床治療肝癌時，以蜈蚣全蟲入藥為宜，并且可適當(dāng)加大蜈蚣的用量。
　　 第三章蜈蚣不同部分提取液對肝臟毒性損害機(jī)

13、制研究
　　 目的:通過檢測SD大鼠肝臟組織MDA、SOD、CytP450、TNF-α、IL-6水平，探討ECPs對肝臟毒性損害的機(jī)制。
　　 方法:硫代巴比妥酸法檢測肝組織MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測肝組織SOD活力，CO還原差示光譜法(Omura法)測定肝組織CytP450含量，雙抗體夾心ABC-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測肝組織TNF-α、IL-6。
　　 結(jié)果:與同期對照組相比，ECPs可引起MD

14、A水平增高、SOD活力降低、CytP450含量降低、TNF-α、IL-6含量增高，差異顯著(P＜0.01，P＜0.05);其中頭足高劑量組IL-6、TNF-α的差異到恢復(fù)期結(jié)束仍然存在（P＜0.05）。同時期同處理組不同劑量水平組內(nèi)比較:高、低劑量之間，以上指標(biāo)存在統(tǒng)計學(xué)差異。同時期同劑量水平不同處理組組間比較:低劑量時，各組間以上指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異;高劑量時，頭足組與全蟲組、頭足組與軀干組比較，MDA、SOD、CytP450、TNF-α