蜈蚣提取液治療肝細(xì)胞肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝細(xì)胞性肝癌(HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，平均生存時(shí)間較短，臨床預(yù)后很差。近20年來(lái)，我國(guó)HCC的治療盡管取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，手術(shù)切除率、術(shù)后生存率及生存質(zhì)量均有較大提高，但與其他腫瘤相比，HCC的療效遠(yuǎn)未如人意。治療方法選擇主要取決于癌癥的分期及肝功能情況。手術(shù)切除(包括肝移植)是公認(rèn)的最有效的根治肝癌方法，應(yīng)作為首選。但由于肝癌進(jìn)展程度不同，以及肝硬化的存在和肝臟儲(chǔ)備功能的差異，適合作肝切除的患者，通常切除率很低(10％～30

2、％)。對(duì)于腫瘤不能手術(shù)切除者或全身情況差不能耐受手術(shù)者，可采取腫瘤的局部及全身治療相結(jié)合方法，盡管目前治療方法很多，但各種方法各有其局限性，對(duì)中、晚期肝癌療效有限。故尋找有效的治療藥物是提高中、晚期肝癌存活率及改善生活質(zhì)量的重要手段，具有重要現(xiàn)實(shí)意義。 在我國(guó)，蜈蚣在疾病預(yù)防和治療中的使用已有兩千余年歷史。近年研究表明蜈蚣全蟲(chóng)提取液有多種作用，其抗腫瘤的效果亦有零星報(bào)道，但研究方法僅見(jiàn)體外的藥敏試驗(yàn)，且確切機(jī)理不詳。為此，以蜈蚣

3、提取液(ECP)作用肝癌細(xì)胞株Bel-7404和裸鼠肝癌Bel-7404移植模型為研究對(duì)象，采用系列方法，旨在闡明ECP治療肝癌的效果及機(jī)制，為ECP臨床治療肝癌提供理論基礎(chǔ)。 第一章蜈蚣提取液對(duì)肝癌Bel-7404細(xì)胞體外抗癌作用及機(jī)制的研究 目的：研究蜈蚣提取液對(duì)肝癌細(xì)胞株的敏感性、作用的細(xì)胞周期時(shí)相及作用機(jī)制，為肝癌的臨床治療提供理論依據(jù)。 方法：體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞Bel-7404，采用不同濃度ECP予以干預(yù)

4、，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞的藥物濃度—時(shí)間生長(zhǎng)曲線(xiàn)研究其對(duì)肝癌細(xì)胞株的敏感性；利用倒置光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物治療組的細(xì)胞周期及其凋亡率；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)及Bax的表達(dá)情況。 結(jié)論：①ECP能抑制人肝癌細(xì)胞Bel-7404的增殖，且抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)；②ECP低濃度有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，中、高濃度直接殺腫瘤細(xì)胞作用。③

5、ECP作用Bel-7404細(xì)胞的G1/G0期，抑制其增殖，并能誘導(dǎo)其凋亡，其作用呈劑量和時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)；④ECP治療肝癌Bel-7404細(xì)胞后能促進(jìn)Bax基因的表達(dá)，抑制XIAP基因的表達(dá)。 第二章蜈蚣提取液體內(nèi)抑癌及作用機(jī)制的研究 目的：研究蜈蚣提取液在體內(nèi)對(duì)肝癌是否有抑制作用，并探討蜈蚣提取液抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。 方法：①建立裸鼠Bel-7404人異位肝癌移植模型，以蜈蚣提取液予以灌服，觀察腫瘤生長(zhǎng)、裸鼠胸

6、腺與脾重量及肝癌轉(zhuǎn)移情況。②運(yùn)用免疫組化法對(duì)腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行XIAP、Bax、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和促血管生成素2(Ang-2)的檢測(cè)。 結(jié)論：①蜈蚣提取液能抑制裸鼠Bel-7404移植瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)理與抑制腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。②蜈蚣提取液能提高荷瘤裸鼠的胸腺指數(shù)及脾指數(shù)，具有增強(qiáng)裸鼠免疫功能作用。 第三章蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法分離治療組肝癌細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白 目的：篩選蜈蚣提取液治療肝

7、癌細(xì)胞后的相關(guān)差異蛋白，探討藥物治療肝癌的機(jī)理。 方法：運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法，采用一步抽提法制備肝癌Bel-7404細(xì)胞株治療組和對(duì)照組的總蛋白質(zhì)，用雙向凝膠電泳技術(shù)建立了重復(fù)性和分辨率均較好的Bel-7404細(xì)胞株治療組和對(duì)照組總蛋白的雙向凝膠電泳圖譜。PDQuest軟件對(duì)兩組細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進(jìn)行了比較，并采用MALDI-TOF-MS對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，獲取MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜，數(shù)據(jù)庫(kù)搜索

8、鑒定主要差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。 結(jié)論：①對(duì)雙向凝膠電泳圖譜分析共發(fā)現(xiàn)76個(gè)差異表達(dá)蛋白，41個(gè)表達(dá)下調(diào)，35個(gè)表達(dá)上調(diào)。②質(zhì)譜分析14個(gè)差異蛋白，PPIA、Lamin-β1、FRase、TBP-2、SAS、GAPDH、P<'21>和Gal-7在Bel-7404治療組中表達(dá)上調(diào)；而6個(gè)蛋白質(zhì)即CK-19、Actin、TERATPase、GSTO1-1、PFNl及ALP在Bel-7404治療組中表達(dá)下調(diào)。提示蜈蚣提取液能多途徑抑制肝癌細(xì)