RNAi抑制HIF-1α的表達對MCF-7細胞MTX藥物敏感性和裸鼠體內(nèi)成瘤性的影響及對hADAS細胞體外向內(nèi)皮細胞分化影響的初步研究.pdf

1、第一部分RNA干擾抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達對乳腺癌MCF-7細胞MTX藥物敏感性和裸鼠體內(nèi)成瘤性的影響 研究目的:以MCF-7細胞為模型探討缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)在乳腺腫瘤生長中的作用；探討以HIF-1α為分子靶點，治療乳腺腫瘤的可能性。 研究方法: 1.應(yīng)用商品化的shRNA表達載體pSilencer2.1-U6hygro，在MCF-7細胞中抑制HIF-1α的表達； 2.應(yīng)用Rea

2、ltimeRT-PCR技術(shù)，研究缺氧(1％O2分壓)條件下，抑制HIF-1α的表達對其靶基因如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(Glut-1)和P-糖蛋白(P-pg)表達的影響； 3.應(yīng)用流式細胞術(shù)研究抑制HIF-1α的表達對細胞周期分布的影響； 4.應(yīng)用MTT比色法研究抑制HIF-1α的表達對化療藥物甲氨喋呤(MTX)敏感性的影響； 5.將細胞接種于裸鼠皮下和乳腺脂肪墊處

3、，通過動物模型來探討抑制HIF-1α的表達對異種移植瘤生長的影響。 研究結(jié)果:與對照組相比，干擾HIF-1α的表達，明顯下調(diào)缺氧條件下VEGF、PGK、Glut-1、P-gp等靶基因的表達，減弱缺氧對細胞周期的抑制，增加細胞對化療藥物MTX的敏感性。裸鼠皮下和同位移植瘤實驗均表明，抑制HIF-1α的表達，能夠明顯抑制腫瘤的生長，其機制可能是通過抑制腫瘤的血管新生和糖代謝過程來發(fā)揮作用。 結(jié)論: 1.HIF-1α是

4、乳腺腫瘤治療潛在的分子靶點，抗HIF-1策略與傳統(tǒng)的化療相結(jié)合可能會得到更好的效果； 2.RNA干擾是一種研究基因功能，發(fā)現(xiàn)及確定腫瘤治療分子靶的有力工具。 第二部分RNA干擾抑制HIF-1α的表達對人脂肪源成體干細胞體外向內(nèi)皮細胞分化影響的初步研究 研究目的: 1.構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在原代培養(yǎng)的人脂肪源成體干細胞(ADAScells)上介導(dǎo)高效、特異的RNAi。 2.研究抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α(

5、HIF-1α)的表達，對ADAS細胞體外向內(nèi)皮細胞分化的影響。 研究方法: 1.把可以在細胞中驅(qū)動表達短發(fā)夾RNA(shRNA)的U6啟動子表達框和增強綠色熒光蛋白(eGFP)基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCVneo中，構(gòu)建以逆轉(zhuǎn)錄病毒為骨架的RNA干擾載體pMSCVneo/eGFP-U6； 2.RealtimeRT-PCR和westernblot實驗分別在mRNA和蛋白水平上證實，利用pMSCVneo/eGFP

6、-U6載體在ADAS細胞中高效、特異地抑制HIF-1α的表達； 3.流式細胞儀研究抑制HIF-1α的表達對ADAS細胞免疫表型和細胞周期的影響； 4.體外將ADAS細胞向成骨和脂肪方向誘導(dǎo)，觀察抑制HIF-1α的表達對其分化能力的影響； 5.體外誘導(dǎo)ADAS細胞向內(nèi)皮細胞分化，觀察抑制HIF-1α的表達對其分化的影響。 研究結(jié)果: 1.利用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCVneo/eGFP-U6可以在人