大鼠羊膜上皮細(xì)胞膠原海綿復(fù)合體的構(gòu)建及其對受損視神經(jīng)的作用.pdf

1、目的：
　　 許多眼科疾病和外傷，如青光眼、視神經(jīng)缺血、頓拌傷、視神經(jīng)管骨折等，都可以使視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)不可逆性凋亡，最終導(dǎo)致視覺功能障礙。目前對于此類疾患仍無有效的治療方法。視神經(jīng)和視網(wǎng)膜作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)在顱外的延伸，在動物手術(shù)位置上具有優(yōu)越性，因而視神經(jīng)損傷模型又常被用來模擬CNS的損傷。因此，本研究從組織工程的角度

2、，構(gòu)建大鼠羊膜上皮細(xì)胞(amniotic epithelial cells，AECs)與膠原海綿復(fù)合體，將其移入大鼠視神經(jīng)損傷模型中，探討其對損傷視神經(jīng)及CNS的作用。
　　 方法：
　　 1)取妊娠晚期的SD大鼠，用胰蛋白酶序貫消化法獲得原代AECs，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測AECs是否表達(dá)CK19、COX10及Nestin，用PKH26標(biāo)記第3代AECs。
　　 2)構(gòu)建AECs與膠原海綿復(fù)合體，在熒光顯微鏡下

3、觀察復(fù)合體內(nèi)AECs的存活。
　　 3)將SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常組、單純損傷組、空支架組和復(fù)合體組。單純損傷組：在左眼視乳頭后約2mm處用1mm注射器針頭切開視神經(jīng)外膜，完全吸除長約0.5mm的視神經(jīng)，保持神經(jīng)外膜的主要血管不受損傷；空支架組：在視神經(jīng)的吸斷處移植相應(yīng)大小的膠原海綿；復(fù)合體組：在視神經(jīng)的吸斷處注入10μl密度為1×107個/ml的細(xì)胞懸液后，移植相應(yīng)大小的復(fù)合體。
　　 4)觀察膠原海綿和復(fù)合體與視神

4、經(jīng)的組織相容性。術(shù)后第7天計數(shù)復(fù)合體內(nèi)的AECs并檢測其Nestin的表達(dá)。術(shù)后第28天，觀察AECs與再生軸突的關(guān)系。
　　 5)檢測復(fù)合體移植對RGCs的作用：HE染色、尼氏染色、CTB-FITC順行示蹤和免疫組織化學(xué)法檢測MAP-2在視網(wǎng)膜中的表達(dá)。
　　 6)檢測復(fù)合體移植對視神經(jīng)的作用：HE染色、CTB-FITC順行示蹤和免疫組織化學(xué)法檢測GFAP、GAP-43在視神經(jīng)中的表達(dá)。
　　 7)用Panor

5、ama Maker-5軟件拼接圖片，用Photoshop CS3軟件計數(shù)和洲量長度，用Image Pro Plus 6.0軟件測量面積，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果：
　　 1)體外培養(yǎng)的AECs可以表達(dá)CK19、COX10和Nestin，AECs具有干細(xì)胞特性和向神經(jīng)類細(xì)胞分化的潛能。
　　 2)復(fù)合體內(nèi)的AECs生物活性好，細(xì)胞密度為604.3個/mm2，48％的AECs表達(dá)Nestin

6、，復(fù)合體內(nèi)部分細(xì)胞仍具有向神經(jīng)類細(xì)胞分化的潛能。
　　 3)術(shù)后第28天至第56天，視神經(jīng)內(nèi)基本不見膠原海綿的空間物理結(jié)構(gòu)，膠原海綿和復(fù)合體與視神經(jīng)的組織相容性好。術(shù)后7天復(fù)合體內(nèi)存活的AECs密度為424.7個/mm2，17％的AECs表達(dá)Nestin。復(fù)合體內(nèi)的AECs至少到第28天還有存活，并可向損傷區(qū)兩側(cè)遷移。復(fù)合體內(nèi)的AECs與再生軸突伴行。復(fù)合體內(nèi)AECs存活率較高，部分AECs具有向神經(jīng)類細(xì)胞分化的潛能，復(fù)合體利于

7、改善視神經(jīng)再生的微環(huán)境。
　　 4)視網(wǎng)膜的尼氏染色顯示：術(shù)后第28天，空支架組節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞直徑≥12μm的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞總數(shù)多于單純損傷組，復(fù)合體組又多于空支架組；細(xì)胞直徑<12μm的細(xì)胞數(shù)量，空支架組和復(fù)合體組多于單純損傷組。復(fù)合體可增加視網(wǎng)膜內(nèi)各類細(xì)胞的數(shù)量，特別是大細(xì)胞；膠原海綿的作用相對較小。
　　 5)視網(wǎng)膜的HE染色顯示：術(shù)后第28天和第56天，各實驗組的節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)、內(nèi)網(wǎng)層厚度和內(nèi)核層厚度均比正常組少。

8、節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)，術(shù)后第28天復(fù)合體組多于單純損傷組和空支架組，術(shù)后第56天復(fù)合體組多于空支架組；內(nèi)網(wǎng)層厚度和內(nèi)核層厚度，術(shù)后第56天復(fù)合體組和空支架組均高于單純損傷組。復(fù)合體比膠原海綿對節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)、內(nèi)網(wǎng)層和內(nèi)核層的增加作用更明顯。
　　 6)CTB-FITC示蹤的RGCs胞體及其視網(wǎng)膜內(nèi)軸突顯示：術(shù)后第28天和第56天，各實驗組視網(wǎng)膜中央、中間和外周的CTB-FITC陽性區(qū)域面積比例均低于正常組。中央：術(shù)后第28天復(fù)合體組最

9、高，空支架組次之，單純損傷組最低；術(shù)后第56天復(fù)合體組和空支架組均高于單純損傷組。中間：術(shù)后第28天各實驗組無明顯差異，術(shù)后第56天復(fù)合體組高于空支架組和單純損傷組。外周：術(shù)后第28天各實驗組無明顯差異；術(shù)后第56天復(fù)合體組高于單純損傷組。復(fù)合體和膠原海綿可增加視網(wǎng)膜內(nèi)存活的RGCs及其軸突，前者效果更為顯著。
　　 7)CTB-FITC示蹤的視神經(jīng)顯示：術(shù)后第28天和第56天，近側(cè)段和損傷區(qū)的CTB-FITC陽性區(qū)域面積比例，

10、復(fù)合體組最高，空支架組次之，單純損傷組最低。復(fù)合體比膠原海綿更能增加再生軸突的數(shù)量，復(fù)合體移植后可促進(jìn)再生的軸突穿過損傷區(qū)到遠(yuǎn)側(cè)段815μm處。
　　 8)免疫組織化學(xué)染色顯示：術(shù)后第28天，各實驗組視網(wǎng)膜每個視野內(nèi)MAP-2陽性物質(zhì)積分光密度均低于正常組，復(fù)合體組最高，空支架組次之，單純損傷組最低，復(fù)合體增加視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)元存活的作用強(qiáng)于膠原海綿。術(shù)后第28天和第56天損傷區(qū)GFAP陽性物質(zhì)平均積分光密度，單純損傷組復(fù)合體組最高

11、，空支架組次之，復(fù)合體組最低，復(fù)合體使損傷區(qū)GFAP表達(dá)減少的作用大于膠原海綿。術(shù)后第28天組損傷區(qū)GAP-43陽性物質(zhì)平均積分光密度，復(fù)合體組最高，空支架組次之，單純損傷組最低，復(fù)合體使損傷區(qū)GAP-43表達(dá)增加的作用大于膠原海綿。
　　 結(jié)論：
　　 1)膠原海綿的空間物理結(jié)構(gòu)有利于AECs粘附和生存。
　　 2)AECs膠原海綿復(fù)合體移植可發(fā)揮AECs與膠原海綿的協(xié)同作用，改善視神經(jīng)軸突再生的局部微環(huán)境，增