人羊膜上皮細胞的干細胞特性及其在不同濃度維甲酸誘導下分化為神經樣細胞的研究.pdf

1、目的:1.建立人羊膜上皮細胞(HAECs)的分離培養(yǎng)體系，對人羊膜上皮細胞進行分離、培養(yǎng)、鑒定、純化及擴增。
　　2.探索人羊膜上皮細胞的胚胎干細胞和神經干細胞特性，研究其誘導分化為神經樣細胞的潛能。
　　3.探索維甲酸誘導人羊膜上皮細胞分化為神經樣細胞的最優(yōu)濃度。
　　方法:1.人羊膜清洗剪碎后先經0.25％Ⅱ型膠原酶消化2小時，然后經0.25％胰酶/0.02％EDTA消化15min后，將細胞懸液以1×107個/ml

2、的密度接種到25ml培養(yǎng)瓶中，倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察細胞變化;免疫組化和免疫熒光方法鑒定貼壁細胞是否為人羊膜上皮細胞。
　　2.采用免疫組化方法鑒定胚胎干細胞特異性標記SSEA-4，Oct-4和神經干細胞特異性標記nestin和musashi在體外培養(yǎng)的人羊膜上皮細胞(HAECs)中的表達情況。
　　3.實驗組使用不同濃度（1×10-8M、1×10-7M、1×10-6M、1×10-5M）的維甲酸在體外誘導人羊膜上皮細胞（HA

3、ECs），未加入維甲酸干預的為對照組。7天后，采用免疫組化、western-blotting、RT-PCR檢測細胞胚胎干細胞特異性標記Oct-4、神經干細胞特異性標記nestin、神經元特異性標記MAP-2和膠質細胞特異性標記GFAP的表達情況，實驗結果采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。
　　結果:1.倒置相差顯微鏡觀察到分離的細胞2-3天后貼壁，之后細胞逐漸變大，折光性降低，整個細胞輪廓變暗，完全伸展的細胞形態(tài)多樣，呈梭形、

4、多角形、眼睛樣等，輪廓清晰，胞漿豐富，胞核呈圓形、卵圓形，核居中。3d后，人羊膜上皮細胞進入指數生長期，細胞數量明顯增多，呈不規(guī)則的多角形，5d-7d左右90％細胞融合成片，形成單層放射狀或漩渦狀生長。細胞免疫組化和免疫熒光顯示全部的貼壁細胞內上皮細胞特異性標記物CK19表達強陽性，而間質細胞特異性標記物vimentin僅在部分細胞內弱陽性表達。
　　2.體外培養(yǎng)的人羊膜上皮細胞內胚胎干細胞特異性標記SSEA-4，Oct-4和神經

5、干細胞特異性標記nestin和musashi表達陽性
　　3.細胞免疫組化、蛋白印跡技術和Real-timePCR結果免疫組化結果:與對照組相比，實驗組中胚胎干細胞標記Oct-4表達降低，神經干細胞特異性標記nestin、神經元特異性標記MAP-2和膠質細胞特異性標記GFAP的表達升高;各實驗組相比較，隨著維甲酸濃度的升高，胚胎干細胞標記Oct-4表達逐漸降低，神經干細胞特異性標記nestin、神經元特異性標記MAP-2和膠質細胞

6、特異性標記GFAP的表達逐漸升高。實驗組中加入10-5M的維甲酸誘導后細胞胞漿內出現(xiàn)空泡樣改變，大量細胞固縮脫落，并可見部分細胞碎片。蛋白印跡結果:隨著維甲酸濃度增高，Nestin，MAP-2和GFAP在蛋白水平表達逐漸增高，而OCT-4蛋白表達逐漸降低。與對照組比較，實驗組nestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表達均明顯增加，并有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。實驗組中1×10-7M較1×10-8Mnestin蛋白、MAP-2蛋白

7、和GFAP蛋白表達增多，且有統(tǒng)計學差異(p＜0.05);1×10-6較1×10-7Mnestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表達增多，且有統(tǒng)計學差異(p＜0.05);1×10-5M較1×10-6Mnestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表達增多，但無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。與對照組比較，實驗組Oct-4蛋白表達均明顯降低，且具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。實驗組中1×10-7M較1×10-8MOct-4蛋白表達降低，且有

8、統(tǒng)計學差異(p＜0.05);1×10-6M較1×10-7MOct-4蛋白表達降低，且有統(tǒng)計學差異(p＜0.05);1×10-5M較1×10-6MOct-4蛋白表達降低，但無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。Real-timePCR結果:與對照組比較，實驗組nestinmRNA、MAP-2mRNA和GFAPmRNA表達均明顯增加，并有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。實驗組中1×10-7M較1×10-8MnestinmRNA、MAP-2mRNA和GF

9、APmRNA表達增多，且有統(tǒng)計學差異(p＜0.05);1×10-6M較1×10-7MnestinmRNA、MAP-2mRNA和GFAPmRNA表達增多，且有統(tǒng)計學差異(p＜0.05);1×10-5M較1×10-6MnestinmRNA、MAP-2mRNA和GFAPmRNA表達增多，但無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。與對照組比較，實驗組Oct-4mRNA表達均明顯降低，且具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，實驗組中1×10-7M較1×10-8M

10、Oct-4mRNA表達降低，且有統(tǒng)計學差異(p＜0.05);1×10-6較1×10-7MOct-4mRNA表達降低，且有統(tǒng)計學差異(p＜0.05);1×10-5較1×10-6MOct-4mRNA表達降低，但無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　結論:1.體外成功完成人羊膜上皮細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定、純化和擴增。
　　2.人羊膜上皮細胞能夠表達胚胎干細胞和神經干細胞的特異性標志，具有胚胎干細胞和神經干細胞特性，并可能具有向神經樣