酶-卟啉復(fù)合體系構(gòu)建及其傳感作用機(jī)制.pdf

1、有機(jī)磷化合物(organophosphorus compounds,Ops)不僅在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,被廣泛應(yīng)用于殺蟲劑和除草劑,還可在軍事中用作化學(xué)戰(zhàn)劑,對(duì)生態(tài)環(huán)境、人身和社會(huì)安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。傳統(tǒng)的檢測(cè)手段雖然定量準(zhǔn)確、靈敏度高,但分析設(shè)備多屬于大型儀器,價(jià)格昂貴,需要專業(yè)人員操作,難于滿足預(yù)防和控制突發(fā)事故的需要。因此,農(nóng)殘檢測(cè)、現(xiàn)實(shí)反恐等迫切需要一種靈敏度高、選擇性好、小巧、輕便、價(jià)格低廉、便于大規(guī)模使用的檢測(cè)手段實(shí)現(xiàn)對(duì)微痕量Ops快

2、速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè),才能切實(shí)保障環(huán)境、社會(huì)和人身安全。鑒于此,本論文著重研究了植物酯酶.卟啉新型復(fù)合敏感材料的制備與篩選,深入研究了其與Ops的作用機(jī)理,為最終構(gòu)建出一種新型的酶.卟啉復(fù)合膜陣列式傳感系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。具體開展的研究工作如下:
　　 (1)在傳統(tǒng)雙水相萃取技術(shù)的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)性研究了萃取過(guò)程參數(shù)(如雙水相類型、成相鹽、PEG分子量及濃度、系統(tǒng)pH值、中性鹽的選擇等)對(duì)植物酯酶分配行為的影響,開發(fā)出一種適于植物酯酶純化

3、的兩步萃取法。第一步萃取中,采用27％PEG1000/13％NaH2PO4雙水相體系,植物酯酶的純化因子(PF)和產(chǎn)率(Y)分別為5.26和85.08％。再進(jìn)行第二步萃取,其體系組成為27％PEG1000/13％NaH2PO4/6.0％(N4)2SO4。經(jīng)過(guò)兩步萃取后,PF和Y分別達(dá)到18.46和83.16％。經(jīng)過(guò)這種方法所得的植物酯酶的純化倍數(shù)是傳統(tǒng)鹽析法的4.8倍。通過(guò)透析法將純化酶中的(NH4)2SO4去除后,經(jīng)冷凍干燥最終得到粉

4、末狀的植物酯酶純酶制品。
　　 (2)以毒性較低的有機(jī)磷毒劑模擬劑甲基磷酸二甲酯(dimethyl methylphosphonate,DMMP)為研究對(duì)象,利用紫外-可見吸收光譜,篩選了具有DMMP敏感性的植物酯酶-卟啉復(fù)合材料。結(jié)果表明,在所研究的復(fù)合材料中,對(duì)DMMP靈敏度最高的是植物酯酶-H2TPPS1(22380.95),其靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他任何材料。其次為植物酯酶-CoTPPC1(1318.30),最差的是植物酯酶-

5、CuTPP(0.94.×10-6)。將植物酯酶-卟啉復(fù)合材料所得的靈敏度與卟啉單獨(dú)檢測(cè)時(shí)的靈敏度進(jìn)行對(duì)比知,將卟啉與植物酯酶相復(fù)合后,除了CuTPP外,其他材料的靈敏度均有很大幅度的提高,其中效果最為突出的是H2TPPS1,其靈敏度提高了3.42×106倍。因此,經(jīng)過(guò)篩選,植物酯酶-H2TPPS1、植物酯酶-CoTPPC1、植物酯酶-ZnTPP、植物酯酶-FeTPPC1和植物酯酶-EuTPPC1等五種復(fù)合材料可以作為候選材料,用于構(gòu)建對(duì)

6、有機(jī)磷毒劑具有高靈敏度的生物傳感器。
　　 (3)為闡明植物酯酶-卟啉復(fù)合敏感材料的檢測(cè)機(jī)理,結(jié)合酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、熒光光譜、UV-Vis吸收光譜等手段,進(jìn)一步深入研究了卟啉-植物酯酶-Ops相互作用關(guān)系。結(jié)果表明,H2TPPS1和DMMP都是植物酯酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。它們與底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶的活性部位,影響底物與酶的正常結(jié)合。但H2TPPS1和DMMP對(duì)植物酯酶的抑制常數(shù)κi不同,κi(H2TPPS1)＞κi(DMMP)。DMMP與植物

7、酯酶之間的親和力要大于H2TPPS1。因此,當(dāng)用H2TPPS1-植物酯酶復(fù)合材料檢測(cè)DMMP時(shí),DMMP會(huì)將H2TPPS1從卟啉-植物酯酶復(fù)合物上置換下來(lái),引起420 nm處吸收峰的降低,從而實(shí)現(xiàn)DMMP的光譜檢測(cè)。
　　 (4)采用戊二醛交聯(lián)法,在玻片基材上制備了固定化植物酯酶-H2TPPS1納米傳感膜。結(jié)果表明,H2TPPS1與固定化植物酯酶作用后會(huì)在422 nm處形成一特征峰。把固定化植物酯酶-H2TPPS1表面暴露于DM