熒光定量PCR定量檢測大腸癌患者血漿游離DNA的甲基化狀態(tài).pdf

1、目的：改進(jìn)一般的熒光染料法消除反應(yīng)中的非特異性擴增，提高反應(yīng)的特異性，并利用這種改進(jìn)的熒光定量PCR定量檢測大腸癌患者血漿游離DNA的MGMT和TPEF基因的甲基化狀態(tài)，計算甲基化MGMT和TPEF的拷貝數(shù)。確定改進(jìn)的熒光定量PCR在定量檢測基因甲基化異常中的可行性。探討MGMT、TPEF基因甲基化異常作為大腸癌早期診斷分子標(biāo)記的潛在價值，及聯(lián)合檢測MGMT和TPEF基因的異常甲基化的意義。 方法：通過對融解曲線的分析，優(yōu)化熒光

2、定量PCR的反應(yīng)條件。根據(jù)亞硫酸鹽修飾原理，對MGMT和TPEF基因的序列進(jìn)行準(zhǔn)確轉(zhuǎn)化，人工合成的目的序列，分別構(gòu)建MGMT和TPEF甲基化陽性質(zhì)粒。利用構(gòu)建的陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，用改進(jìn)后的熒光定量PCR法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后定量檢測大腸癌患者血漿游離DNA中MGMT和TPEF基因甲基化異常，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出甲基化的MGMT和TPEF的拷貝數(shù)。 結(jié)果：35例大腸癌患者血漿DNA標(biāo)本中，10例為檢測出有甲基化的MGMT，21例檢測

3、結(jié)果為TPEF陽性，陽性率分別為28.6％和60％，35例標(biāo)本中有23例至少存在MGMT或TPEF中的一個基因甲基化，即聯(lián)合MGMT和TPEF基因檢測的陽性率為65.7％，并且異常甲基化MGMT基因的含量范圍為：23-184拷貝/ml；甲基化TPEF基因的含量范圍為：13-163拷貝/ml。 結(jié)論：改進(jìn)的熒光定量MSP檢測MGMT和TPEF甲基化狀態(tài)方法可行，結(jié)果可靠。MGMT和TPEF基因的異常甲基化均有望成為大腸癌早期診斷的