SYBR GreenⅠ熒光PCR檢測(cè)DNA甲基化——方法建立及其在肝癌甲基化標(biāo)志物檢測(cè)中的初步應(yīng)用.pdf

1、DNA甲基化指哺乳動(dòng)物基因組DNA的胞嘧啶(C)的5'位通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)介導(dǎo)發(fā)生的甲基化修飾反應(yīng)，此反應(yīng)主要發(fā)生在5'-CG-3'的DNA序列中，即CpG位點(diǎn)甲基化。DNA甲基化為表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，并且是目前研究的比較成熟的部分。DNA甲基化可以影響基因表達(dá)、染色體穩(wěn)定性、X染色體轉(zhuǎn)錄沉默、基因組印跡以及染色質(zhì)濃縮，而且是可以遺傳的，但它卻并不改變基因DNA的編碼序列。D

2、NA甲基化與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，通過檢測(cè)基因所發(fā)生的異常DNA甲基化改變而對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷和治療監(jiān)測(cè)具有重要意義。 隨著對(duì)DNA甲基化研究的深入，DNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展也不斷更新。亞硫酸氫鹽修飾DNA方法的發(fā)明，使DNA甲基化檢測(cè)的瓶頸得以解決。該方法通過化學(xué)修飾作用，使DNA中發(fā)生了甲基化修飾的胞嘧啶(C)保持不變，而未發(fā)生甲基化的胞嘧啶則轉(zhuǎn)化U并在后續(xù)的PCR反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為T。這使得本來沒有差異的DNA序列被人為的引入了差異，也使得

3、PCR等檢測(cè)方法在DNA甲基化檢測(cè)中的應(yīng)用成為了現(xiàn)實(shí)。目前，基于亞硫酸氫鹽修飾的DNA甲基化檢測(cè)方法包括MSP。Methylight，COBRA等。但是這些方法相對(duì)比較繁瑣，比如MSP方法需要進(jìn)行電泳和紫外成像，Methylight需要設(shè)計(jì)特異的探針，而COBRA只能對(duì)幾個(gè)特異的位點(diǎn)進(jìn)行酶切，因此該類方法直接應(yīng)用于臨床檢測(cè)均存在很大的困難。本課題則將SYBR Green Ⅰ熒光PCR應(yīng)用于DNA甲基化的檢測(cè)，直接應(yīng)用MSP的引物并加入S

4、YBR GreenⅠ熒光染料，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化檢測(cè)。應(yīng)用此方法對(duì)與原發(fā)性肝癌(HCC)的潛在腫瘤標(biāo)志物MAGE-A1，A3基因異常甲基化改變進(jìn)行臨床血漿標(biāo)本的檢測(cè)，確認(rèn)該方法的臨床適用性及檢測(cè)效能。實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋菊n題擬建立一種SYBR Green Ⅰ熒光PCR檢測(cè)DNA甲基化的方法，并對(duì)該方法的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。然后，將該方法應(yīng)用于原發(fā)性肝癌(HCC)中具有診斷價(jià)值的MAGE-A1，A3甲基化改變的檢測(cè)中。檢測(cè)HCC血漿標(biāo)本，肝炎標(biāo)本和正常對(duì)