ERK-MAPK信號傳導影響大腸癌DNA甲基化的in vitro 和in vivo研究.pdf

1、背景：腸黏膜細胞不斷脫落更新，易受細胞外異常信號的刺激而發(fā)生癌變。細胞外信號傳導通路ERK-MAPK和DNA甲基化異常在大腸癌變的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，二者相互影響，是極具抗腫瘤潛力的治療靶點。迄今為止，從細胞學和實驗動物學角度系統(tǒng)性研究ERK-MAPK信號通路（RAF/MEK/ERK）對大腸癌腫瘤相關基因表達的影響尚未見報道，這種影響是否通過DNA甲基化的調控而實現(xiàn)有待進一步證實。 目的：觀察ERK-MAPK信號通路對大腸癌細

2、胞增殖和細胞周期的影響，以及其抑制劑對小鼠大腸癌的防治效果，初步探討ERK-MAPK信號對腫瘤相關基因表達的分子機制，進一步明確DNA甲基化是否受ERK-MAPK通路的調控，為大腸癌的分子治療提供理論基礎。 方法：培養(yǎng)人大腸癌細胞系SW1116和小鼠成纖維細胞系NIH 3T3，分別以人MEK基因和小鼠ERK基因為靶點構建siRNA表達載體。脂質體法介導RAF基因表達載體pCMV-RAF和MEK siRNA表達載體穩(wěn)定轉染SW11

3、16細胞，觀察細胞形態(tài)學變化，四唑藍（MTT）測定細胞活力，軟瓊脂集落形成實驗檢測細胞增殖，流式細胞術分析細胞周期變化。 實時定量PCR檢測DNA甲基轉移酶和抑癌基因p16INK4A、p21WAF1和p27KIP1 轉錄水平。以Western blotting分析各組細胞內以上基因的蛋白表達以及MEK1/2、ERK1/2磷酸化水平和細胞核增殖核抗原（PCNA）蛋白表達情況。亞硫酸氫鹽修飾DNA測序和甲基化特異性PCR（MSP）分

4、析抑癌基因啟動子甲基化情況。體內研究采用二甲肼誘導小鼠大腸癌模型，在造模過程中給予MEK抑制劑PD98059或ERK siRNA基因轉導干預，觀察大腸腫瘤的大小和發(fā)生率，定量PCR和Western blotting檢測腫瘤相關基因在正常組織和腫瘤組織的差異，MSP分析抑癌基因DNA甲基化情況。 結果：成功地構建了人MEK siRNA表達質粒和小鼠ERK siRNA表達質粒，分別轉染SW1116和NIH 3T3細胞，轉染效率50％

5、~63％，抑制效率為76％~92％，轉染細胞中ERK-MAPK信號通路激酶MEK或ERK表達下降，甚至消失；轉染RAF于SW1116細胞可激活ERK-MAPK通路激酶。 與轉染空質粒相比，RAF可顯著提高細胞生長活力，增加軟瓊脂集落形成數(shù)目和體積，明顯改變細胞周期分布，G1期細胞百分比減少，S期細胞百分比增加(P<0.05)；MEK siRNA部分逆轉了腫瘤的惡性程度，細胞活力和增殖力下降，細胞周期阻滯于G1期，S期細胞減少，細

6、胞形態(tài)狹長，胞質減少，排列較整齊。 RAF可促進ERK-MAPK信號通路激酶MEK和ERK的磷酸化，促進細胞增殖和細胞周期進展，上調甲基化酶Dnmt的表達，并伴有PCNA的表達升高，而細胞周期相關蛋白p21WAF1、 p16INK4A和p27KIP1降低。MEK siRNA可下調MEK和ERK及其磷酸化水平p-MEK和p-ERK的表達，抑制細胞增殖，下調甲基化酶Dnmt1和PCNA蛋白表達，恢復細胞周期蛋白p21WAF1和 p1

7、6INK4A的轉錄和翻譯；MSP分析MEK siRNA可使抑癌基因p16INK4A去甲基化和p21WAF1部分去甲基化，測序分析進一步證實了其啟動子區(qū)CpG島呈低甲基化狀態(tài)。 PD98059可顯著降低小鼠大腸癌的發(fā)生率（25％），降低ERK-MAPK信號通路MEK和ERK的磷酸化水平，并降低甲基化酶Dnmt1和Dnmt3b的表達，誘導抑癌基因p21WAF1、 p16INK4A和p27KIP1的表達。ERK siRNA基因小鼠體內