ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及發(fā)酵的研究.pdf

1、隨著人們對食品安全性的認識和要求的逐步提高，化學防腐劑受到嚴峻挑戰(zhàn)，食品防霉防腐劑的天然化已成為今后的發(fā)展趨勢。開發(fā)抗菌性強、安全無毒的天然防腐劑已成為各國食品科技工作者的研究重點。 ε-聚賴氨酸(ε-Poly-lysine，ε-PL)是目前天然防腐劑中具有優(yōu)良防腐性能和巨大商業(yè)潛力的微生物類食品防腐劑。ε-PL是由20-35個賴氨酸殘基通過α-羧基和ε-氨基聚合成的具有抑菌功效的多肽。它具有安全性高、對革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性

2、菌，真菌等都有廣泛的抑制作用等優(yōu)點，且熱穩(wěn)定性，水溶性好。在食品保鮮防腐、醫(yī)學等方面都有廣泛的應用。因此ε-PL的研究開發(fā)具有十分重要的理論意義和應用價值。 本研究對ε-PL產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其發(fā)酵高產(chǎn)的條件進行了系統(tǒng)的研究，并在此基礎上探討了ε-PL的提取工藝、生物活性、抑菌和生物合成的機理，取得了以下結(jié)果與進展。 1、ε-PL含量測定的最佳反應體系建立本研究建立了測定ε-PL含量的最佳反應體系，即2mL濃度為0-1

3、.20g/L的ε-PL與2mL濃度為0.75mmol.L甲基橙的混合，混合液振蕩30分鐘，室溫下離心15分鐘，速度是4000轉(zhuǎn)/分，上清夜稀釋20倍，測465nm吸光度。而且當反應液中含半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、對測定結(jié)果有影響。同時，通過最佳體系，進行了標準曲線的測定。 2、ε-PL產(chǎn)生菌的篩選與鑒定本研究通過用形態(tài)特征和生理生化特征對土樣進行初篩，用濾紙片抑菌圈法進行復篩和搖瓶發(fā)酵測定ε-PL產(chǎn)量，篩選出一株ε-PL產(chǎn)生菌-

4、菌株B-215，ε-PL產(chǎn)量為0.65g/L。對菌株B-215的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、16SrRNA基因序列進行了系統(tǒng)的研究與分析。結(jié)果表明，菌株B-215具有E-PL產(chǎn)生菌的典型的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征。以16S rDNA全序列為基礎的系統(tǒng)發(fā)育樹與Streptomyces albus的序列同源性最高，達99％。綜合形態(tài)、生理生化和化學分類特征，對照參考文獻，將菌株B-215的鑒定結(jié)果定名為：白色鏈霉菌B-215(

5、Streptomyces albus B-215)。 3、e-PL高產(chǎn)菌株的選育及培養(yǎng)條件研究Streptomyces albus B-215通過紫外誘變，得到一株ε-PL產(chǎn)量為0.75 g/L的突變株Streptomvces albus BU.215，比未誘變的產(chǎn)量提高20.97％。其發(fā)酵液抑菌圈的H/C為1.56，比對照菌株高25.81％。 單因子實驗結(jié)果表明，對Streptomyces albus BU-215發(fā)酵

6、產(chǎn)ε-PL具有顯著影響的培Ⅰ養(yǎng)基因子是葡萄糖、酵母膏、KH2P04、 (NH4)2S04、初始pH、接種量、轉(zhuǎn)速和裝液量。發(fā)酵液的ε-PL，含量對關鍵培養(yǎng)基因子的多元回歸方程：Y=0.8354+0.034X<,1>-0.03X<,2>+0.007X<,3>-0.0047X<,4>+0.024X<,1>+0.025X<,1>X<,3>+0.012X<,1>X<,4>-0.0593X<,2>X<,3>-0.03X<,2>X<,4>-0.03

7、3X<,3>X<,4>-0.032X<,2>^2-0.024<,x2>^2-0.0078X<,3>^2+0.015X<,4>^2由方程可以看出A(葡萄糖)、B(硫酸銨)、AB項、AC項、BC(磷酸二氫鉀)項、BD(酵母膏)項、CD項對ε-PL含量的影響均達到顯著水平，方程擬合優(yōu)度好，R<'2>值為0.9583，R<'2>Adj值為0.9184，二者均達到顯著水平。預測值與實測值具有高度相關性，R<'2>pre=0.7834。 發(fā)

8、酵液的ε-PL，含量對關鍵發(fā)酵條件的多元回歸方程： Y=0.96-0.0024X<,1>+0.098X<,2>+0.052X<,3>+0.011X<,4>-0.044X<,1>X<,2>+0.005X<,1>X<,3>+0.019X<,1>X<,4>-0.016X<,2>X<,3>-0.008X<,2>X<,4>+0.027X<,3>X<,4>-0.001 7X<,1>^2-0.047X<,2>^2-0.023X<,3>^2+0

9、.0045X<,4>^2方程極顯著(P<0.0001)其中B(pH)、C(接種量)、.AB項、AD項、B^2、C^2對ε-PL含量的影響均達到極顯著水平。此處R<'2>值為0.9461.R<'2>Adj值為0.8958，二者均達到顯著水平，表明擬合優(yōu)度好，預測值與實測值具有高度相關性，R<'2>pre=0.8373。 通過響應面法設計和分析得到的優(yōu)化結(jié)果為：葡萄糖55.50g/L，硫酸銨12.25g/L，磷酸二氫鉀1.72g/L

10、，酵母膏7.80g/L，裝液量50ml/500ml,pH=7，接種量10％，轉(zhuǎn)速180rpm，ε-PL產(chǎn)量為1.085g/L。驗證實驗表明實驗模型準確、可靠，說明RSB法可以推廣應用于各種各樣的生物過程優(yōu)化中。 4、ε-PL提取方法的研究堿變性法除雜蛋白的效果比較好，預處理后蛋白含量減少了48.57％，而ε-PL量變化不大，只損失了4.08％。 由圓盤電泳結(jié)果和薄層層析結(jié)果說明，提取后的收集液中只含有一種多肽，Strep

11、tomyces albus BU-215提取液中活性多肽氨基酸組成分析說明，多肽水解后主要含有賴氨酸。在此可以確定這種多肽就是PL，即Streptomyces albus BU-215是產(chǎn)PL的菌株。說明本研究所使用的ε-PL的提取工藝是適合的。 5、ε-PL的生物活性及生物合成機理ε-PL的生物活性高，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠色木霉、啤酒酵母、紅酵母、蘇云金芽孢桿菌和番茄灰霉病菌都有強的抑菌效果，是一種廣譜天然抑菌劑

12、。同時PL的熱穩(wěn)定性非常好，其在高溫情況下不分解，不失活，能夠承受一般食品加工過程中的熱處理，可以隨原料一同進行滅菌處理，防止二次污染。 電鏡結(jié)果表明：ε-PL抑菌機理主要表現(xiàn)在破壞微生物的細胞膜結(jié)構(gòu)，使細胞喪失對物質(zhì)的選擇性，并可導致胞內(nèi)溶酶體膜破裂而誘導微生物產(chǎn)生自溶作用，最終導致細胞死亡。ε-PL的生物合成與其產(chǎn)生菌白色鏈霉菌BU-215中的質(zhì)粒有關。質(zhì)粒消除后的白色鏈霉菌BU-215的發(fā)酵液沒有抑菌效果，且發(fā)酵液中ε-P