毛囊培養(yǎng)上清液誘導骨髓間充質干細胞分化的初步研究.pdf

1、目的：皮膚是人體最大的器官，在抵御微生物入侵，紫外線輻射以及防止水分的丟失、調節(jié)體溫方面起重要作用，同時也是免疫系統(tǒng)的組成部分之一。皮膚創(chuàng)傷后的再生以及修復，主要是由鄰近、健康的細胞分裂、增殖來實現(xiàn)的。但是大面積Ⅲ度燒傷、廣泛瘢痕切除、外傷性皮膚缺損以及皮膚潰瘍等導致的嚴重皮膚缺損，特別是大面積Ⅲ度燒傷，傷及皮膚全層及其附屬器，僅靠創(chuàng)面自身難以實現(xiàn)皮膚的再生，因而需要足夠的皮膚替代物進行修復。雖然組織工程化皮膚是世界上第一種獲得批準的組

2、織工程產品，并在治療頑固性潰瘍和嚴重燒傷患者方面取得很好的療效，但是迄今未能合成含有皮膚附屬器(毛囊、汗腺、皮脂腺等)的皮膚。因此，目前尚無一種人工皮膚能完全滿足創(chuàng)面修復在功能上的需要，存在的一個共同問題是均不能重建毛囊、汗腺、皮脂腺等皮膚附屬器，降低了皮膚對環(huán)境的適應能力，如何實現(xiàn)皮膚的功能重建成為當前創(chuàng)傷修復的研究熱點。 干細胞理論技術的發(fā)展為在重建皮膚創(chuàng)傷組織解剖結構的同時恢復其生理功能帶來了希望。干細胞具有終身、無限增殖

3、能力，而且在一定條件下，可以分化為各種功能的細胞。干細胞主要包括胚胎干細胞和成體干細胞兩大類。胚胎干細胞由于涉及倫理學問題，目前大規(guī)模的基礎研究和臨床應用受到一定限制，因此成體干細胞的研究倍受重視。雖然近年來毛囊干細胞成為組織工程的新種子細胞備受關注，但是毛囊干細胞的分離純化技術還不完善，而且沒有建立完善的培養(yǎng)擴增體系。在一定條件下，具有自我更新與多向分化潛能的成體干細胞即骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，

4、MSCs)可以分化為同胚層的骨、軟骨、脂肪、心肌細胞以及肝細胞等，也可以跨胚層分化為肺上皮細胞、腸上皮細胞、神經細胞以及表皮細胞等。由于MSCs取材方便，分離培養(yǎng)技術簡單，具有高度增殖性且體外培養(yǎng)時保持了生物學特性的穩(wěn)定，擴增以及導入外源基因也相對方便，并且通過骨髓穿刺從自體獲得，因此由它誘導來的細胞在進行移植時不存在組織配型及免疫排斥的問題，目前MSCs已成為細胞移植的首選靶細胞。有報道，MSCs經自體移植作用于創(chuàng)面局部后，在皮膚微環(huán)

5、境中分化為血管內皮細胞、表皮細胞和皮脂腺導管細胞。因此，MSCs在未來的皮膚創(chuàng)傷修復的實際應用中具有潛在的優(yōu)勢。 MSCs分化的機理和誘導條件迄今為止還不清楚，大多數(shù)人認為MSCs的分化與其所處的微環(huán)境“壁龕”密切相關，不同的組織細胞微環(huán)境有著不同的細胞因子，可能是誘導MSCs獲得靶組織的表型，并向不同細胞譜系分化的主要原因之一。已有研究證實，視網膜細胞培養(yǎng)上清液可以誘導骨髓間充質干細胞向神經元、膠質細胞與視細胞分化。本實驗采用

6、毛囊培養(yǎng)上清液模擬體內的微環(huán)境，探討MSCs是否具有向毛囊干細胞分化的潛能，從形態(tài)學、免疫細胞化學、免疫熒光細胞化學以及基因表達等多個方面鑒定，從而探討MSCs在將來皮膚創(chuàng)傷修復實際應用中的潛在優(yōu)勢，促使人們探討能否利用骨髓間充質干細胞的誘導分化來重建皮膚的解剖結構和生理功能。 方法 體重100g雄性Wistar大鼠脫頸椎處死，采用貼壁法，通過差速貼壁法去除非貼壁的造血細胞，獲得相對均質的MSCs，細胞爬片，固定，進行C

7、D44、CD29免疫細胞化學染色鑒定。無菌條件下，取上述同一只Wistar大鼠觸須部皮膚，用顯微外科器械分離毛囊于24孔培養(yǎng)板中，每天收集培養(yǎng)上清液，過濾后與DMEM培養(yǎng)液按2：3混合，用此混合培養(yǎng)液對第3代MSCs進行誘導，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，對誘導后的細胞進行K15、CD34免疫細胞化學染色和免疫熒光細胞化學染色，計算細胞轉化率，然后利用RT-PCR進一步檢測誘導后K15、CD34mRNA的表達。 結果

8、一、MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 MSCs原代培養(yǎng)接種后12h可見少數(shù)細胞開始貼壁，細胞形態(tài)呈成纖維樣細胞，并很快形成集落。24h后首次換液， 3天后細胞增殖加快，呈集落樣迅速生長，7天后細胞達到80％融合，2-3代后MSCs呈梭形，細胞核較大、核仁明顯，95％以上形態(tài)均勻一致，CD44、CD29免疫細胞化學染色顯示細胞膜呈棕黃色。 二、毛囊的器官培養(yǎng)及觀察 毛囊接種培養(yǎng)后第1天，大部分毛囊開始生長，表現(xiàn)為毛囊逐漸

9、延長，生長延長主要集中在前4天，到第7天后部分毛囊開始貼壁，逐漸發(fā)現(xiàn)有成纖維樣細胞和上皮樣細胞從毛囊長出，并逐漸增殖生長，呈鋪路石樣，到第10天以后毛囊大部分貼壁，生長緩慢，基本無變化。 三、MSCs在條件培養(yǎng)液誘導后的培養(yǎng)、觀察及鑒定 1、第3代MSCs經條件培養(yǎng)液誘導后第7天，可見少數(shù)細胞發(fā)生形態(tài)改變，隨著時間的延長，逐漸由原來的梭形向角質樣細胞的形態(tài)轉變。 2、第3代MSCs誘導21天后，K15、CD34免

10、疫細胞化學染色和免疫熒光細胞化學染色顯示部分陽性細胞，K15陽性率為62.8％，CD34陽性率為35.5％，未誘導的骨髓間充質干細胞中CD34、K15呈陰性。 3、第3代MSCs體外誘導21天后，RT-PCR檢測CD34、K19表達陽性。 討論 大面積皮膚燒傷、慢性潰瘍、創(chuàng)傷、皮膚腫瘤切除或其它皮膚疾病，導致皮膚全層及其附屬器的嚴重缺損，需要足夠的皮膚替代物進行修復。目前尚無一種人工皮膚能完全滿足創(chuàng)面修復在功能上

11、的需要，存在的一個共同問題是均不能重建毛囊、汗腺、皮脂腺等皮膚附屬器，降低了移植皮膚對外界環(huán)境的適應能力，如何實現(xiàn)皮膚移植后的功能重建成為當前創(chuàng)傷修復的研究熱點。 由于MSCs取材方便，分離培養(yǎng)技術簡單，具有高度增殖性且體外培養(yǎng)時保持了穩(wěn)定的生物學特性，擴增以及導入外源基因也相對方便，由它誘導來的細胞在進行移植時不存在組織配型及免疫排斥的問題，目前已成為組織工程中細胞移植的首選靶細胞。王海萍等利用5-氮胞苷(5-aza)誘導骨髓

12、間充質干細胞分化為心肌樣細胞。本實驗室潘峰等成功地誘導MSCs向成骨樣細胞方向分化。已有研究證實MSCs經自體移植作用于創(chuàng)面局部后，在皮膚微環(huán)境中分化為血管內皮細胞、表皮細胞和皮脂腺導管細胞。Nakagawa等人通過將MSCs種植到人工皮膚上以修復皮膚缺損的裸鼠，證實MSCs具有促進傷口愈合的潛能。McFarlin等人將MSCs注射到皮膚損傷的部分，證實MSCs能有效促進皮膚創(chuàng)面的愈合。雖然在皮膚組織工程中，毛囊干細胞作為種子細胞的研究

13、已取得進展，但是其分離和純化還有待于進一步研究。本實驗利用每天收集的毛囊培養(yǎng)上清液模擬體內的微環(huán)境，毛囊器官培養(yǎng)過程中分泌的細胞因子(KCF、FGF、VEGF等)不斷作用于MSCs，培養(yǎng)3周后可以看到誘導后的細胞具有典型的角質樣細胞的形態(tài)特征，呈多角形，胞核偏大，特異性地表達K15、CD34，K15、CD34是近兩年來發(fā)現(xiàn)的在毛囊干細胞高表達的分子標記，表明在毛囊培養(yǎng)液的誘導下，MSCs具有向毛囊干細胞分化的潛能，為誘導MSCs進一步分

14、化為表皮、真皮以及皮膚附屬器奠定了基礎。 本實驗利用毛囊培養(yǎng)上清液誘導MSCs分化為毛囊干細胞樣的細胞，使得合成具有完整解剖結構和良好功能的皮膚成為可能。本實驗初步證明了在體外的誘導條件下，MSCs具有向毛囊干細胞分化的巨大潛能，并且為進一步分化為表皮、真皮和皮膚附屬器的研究奠定了基礎，但是，MSCs誘導后進一步分化為皮膚附屬器的可能性需進一步做嚴格的動物實驗，進行深入細致的探究，另外，MSCs向毛囊干細胞分化的分子機制以及分化