骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上清液的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、目的：本實驗研究旨在探討B(tài)MSCs的移植機(jī)制，主要包括以下兩個方面：①檢測人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(HumanBoneMarrowStromalCells，hBMSCs)向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后培養(yǎng)液上清中NGF含量，觀察其變化情況；探討hBMSCs在傳代培養(yǎng)過程和向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中的分泌作用及其機(jī)制。②觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上清液經(jīng)尾靜脈注射治療大鼠腦缺血后第七天原位神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、分化情況以及大鼠神經(jīng)功能改善情況，評價上清液治療價值并探

2、討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植之后體內(nèi)作用機(jī)制。 方法：從健康志愿者髂骨處抽取骨髓5ml，在體外進(jìn)行分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、傳代，當(dāng)傳至第5代時，分別收集1d、3d、5d、7d上層培養(yǎng)液，使用ELISA法檢測以上各時間點hBMSCs培養(yǎng)液上清中NGF的濃度，然后用400ng/L音猥因子(Sonichedhehog，Shh)、0.5μM維甲酸(Retinoicacid，Ra)和5μM福斯克林(Forskolin，F(xiàn)n)組成的誘導(dǎo)體系對hBMSC

3、s進(jìn)行誘導(dǎo)，檢測誘導(dǎo)前(12h、1d、3d)和誘導(dǎo)后(12h、1d、3d)的上清液中NGF含量，觀察其變化；選取16只健康Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血對照組、上清液低濃度組、上清液高濃度組，后三組建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型(MCAO)，模型制作24h后各組腹腔注射5-溴脫氧尿核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)用以標(biāo)記處于增殖狀態(tài)的神經(jīng)前體細(xì)胞，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測缺血后7d腦組織BrdU、BrdU+

4、NSE、BrdU+GFAP陽性細(xì)胞數(shù)。對缺血對照組、上清液低濃度組、上清液高濃度組三組大鼠在上清液干預(yù)治療前后進(jìn)行神經(jīng)功能評分，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果：hBMSCs培養(yǎng)液中含有NGF，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液中NGF的濃度增加；hBMSCs后期誘導(dǎo)液中也含有NGF，且誘導(dǎo)后各時間點(12h、1d、3d)濃度均明顯高于誘導(dǎo)前(12h、1d、3d)(P<0.01)。使用hBMSCs培養(yǎng)上清液干預(yù)治療，腦梗死后7d側(cè)腦室室管膜下

5、區(qū)、海馬齒狀回區(qū)BrdU、BrdU+NSE、BrdU+GFAP陽性細(xì)胞數(shù)開始增多，且上清液高濃度組的上述陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組(P<0.05)和低濃度組(P<0.05)。使用BMSCs上清液干預(yù)治療的7d時間內(nèi)，相同時間點(1d、4d、7d)在缺血對照組、上清液低濃度組、上清液高濃度組大鼠之間兩兩比較，神經(jīng)功能評分無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；同一組內(nèi)大鼠不同時間點(1d、4d、7d)兩兩比較，神經(jīng)功能評分無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)