中國漢族人群基因多態(tài)性與急性高原病關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　急性高原病(AMS)的發(fā)生是一個多基因、多因素參與的復(fù)雜過程,受遺傳和環(huán)境雙重影響。高原病的發(fā)生發(fā)展呈現(xiàn)明顯的種族和個體差異性。青藏高原是目前世界上高原面積最大、海拔最高、居住人口最多的高原地區(qū)。我國中西部約有1/2是高原地區(qū),有115個行政縣位于海拔3000m以上的高原,其中四大高原(青藏高原、內(nèi)蒙高原、云貴高原以及黃土高原)的居住人口在6000~8000萬左右。目前,隨著高原地區(qū)經(jīng)濟(jì)建設(shè)、高山旅游業(yè)的蓬勃

2、發(fā)展以及軍事戰(zhàn)略意義日趨突出,越來越多的人群從平原通過各種方式進(jìn)入高原。但是由于惡劣的地理環(huán)境和自然氣候,各種類型的高原病時有發(fā)生,尤其是急性高原病嚴(yán)重影響了平原地區(qū)與高原地區(qū)的人口流動,長期以來阻礙了相互間的貿(mào)易交流、交通建設(shè)和資源開發(fā),嚴(yán)重制約了高原地區(qū)經(jīng)濟(jì)建設(shè)和社會發(fā)展。有研究表明,在急進(jìn)至海拔2500米以上人群中AMS的發(fā)病率約為10％,4500米以上則超過60%,嚴(yán)重者還可能轉(zhuǎn)化為急性重癥高原病,即高原肺水腫及腦水腫,有著較高

3、的致殘率和致死率。由于高原地區(qū)醫(yī)療環(huán)境及技術(shù)的限制,特別是部分急性重癥病人不能有效地開展現(xiàn)場急救,嚴(yán)重危及患者生命。這對如何積極有效地防治急性高原病的發(fā)生提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
　　近年來,隨著國家對高原病衛(wèi)生事業(yè)的重視,有關(guān)高原病的研究也取得了一定成果。其中以表觀遺傳學(xué),基因多態(tài)性等遺傳作為研究背景材料的課題更是受到各國學(xué)者的重視。目前,個體遺傳背景同急性高原病易感性之間的關(guān)系還不是十分清楚,分子機(jī)制也尚不明確。我們試圖通過尋找高原

4、病相關(guān)調(diào)控基因多態(tài)性的方法來解答這一問題,利用AMS病例對照設(shè)計研究,闡述基因多態(tài)性同AMS易感性之間的關(guān)系,從而為急性高原病的早期預(yù)防提供理論依據(jù)。
　　急性缺氧是高原病發(fā)生的始動環(huán)節(jié),而缺氧誘導(dǎo)因子HIF,作為缺氧應(yīng)答的全局性調(diào)控因子,在急性高原病的發(fā)生發(fā)展過程中起到了非常關(guān)鍵的調(diào)控作用。EPAS1(HIF2α)、EGLN1(HIFPH2)基因作為HIF調(diào)節(jié)通路上的靶基因,其遺傳變異很可能會引起機(jī)體對于缺氧適應(yīng)性方面的改變。研

5、究表明,EPAS1、EGLN1基因多態(tài)性的改變與血紅蛋白含量改變,血管生成及通透性改變,血流動力學(xué)改變等有關(guān),而這些變化都同高原適應(yīng)有些非常密切的關(guān)系。近年來隨著大規(guī)模全基因組掃描(GWAS)技術(shù)及基因測序等一系列檢測方法的問世,通過高原世居藏族人群同平原漢族人群對照研究中的應(yīng)用表明,EPAS1、EGLN1等基因與高原適應(yīng)性和高原病有很強(qiáng)相關(guān)性。
　　目前,關(guān)于EPAS1、EGLN1基因同高原適應(yīng)的相關(guān)性已有文獻(xiàn)報道,但是文獻(xiàn)中所

6、涉及的病例對照研究基本上均為高原地區(qū)世居藏族人群同平原漢族人群不同種族之間的比較,而單純的在平原漢族人群中該兩個基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性同急性高原病易感性間有無關(guān)聯(lián)性尚待考證。為此,本實驗擬通過對急性高原病病例對照研究,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增及連接酶檢測(PCR-LDR)方法對SNP進(jìn)行基因分型檢測,試圖發(fā)現(xiàn)EPAS1、EGLN1基因遺傳變異與急進(jìn)高原人群在缺氧環(huán)境暴露中高原病發(fā)病的關(guān)聯(lián)性,并在此基礎(chǔ)上探討SNP位點(diǎn)和EPAS1、EGLN1基

7、因調(diào)控機(jī)制。本研究樣本來源相同,進(jìn)入高原的時間和海拔高度一致,通過比較其是否發(fā)病,以及發(fā)病的嚴(yán)重程度等,為急性高原病的預(yù)警等提供依據(jù)。
　　材料與方法:
　　1.本研究選取2012年7月由重慶(海拔300米)空運(yùn)急進(jìn)至拉薩(海拔3700米)的健康男性青年。根據(jù)急性高山病路易斯湖國際診斷計分系統(tǒng)(LLS)對受試人群進(jìn)行評分,其中AMS病例組80人,平均年齡(20.54±0.26)歲;對照組86人,平均年齡(21.02±0.25

8、)歲;均來自中國平原地區(qū)且無血緣關(guān)系漢族人群。
　　2.抽取每位研究對象空腹肘靜脈血5ml,EDTA-K2抗凝管采集后隨即在室溫下用TD4臺式離心機(jī)3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,用移液器分離血漿及血細(xì)胞,存于無菌干燥凍存管中,標(biāo)注編號并放入液氮罐中凍存。血細(xì)胞利用TiangenDP319-02DNA抽提試劑盒(中國天根公司)提取基因組DNA。
　　3.從病例組和對照組中隨機(jī)選取各20例血標(biāo)本,分別對EPAS1基因rs20444

9、56、rs4953348、rs4953361位點(diǎn),EGLN1基因rs2153364、rs479200位點(diǎn)目的基因片段進(jìn)行測序。
　　4.分別收集80名AMS病例組及86名對照組受試人群,對EPAS1基因位點(diǎn)rs2044456、rs4953348采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增及連接酶檢測(PCR-LDR)技術(shù)對其進(jìn)行基因分型檢測。LDR反應(yīng)產(chǎn)物在ABI3730XL測序儀下測序分析。
　　結(jié)果:
　　1.比較急性高原病病例對照受試人

10、群,兩組間性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。對于反應(yīng)AMS的臨床客觀指標(biāo)心率及血氧飽和度,在平原病例對照組間心率及血氧飽和度水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。高原AMS病例組心率平均水平明顯高于對照組(P<0.01);而AMS病例血氧飽和度平均水平則明顯低于對照組(P<0.01)。
　　2.我們對EPAS1基因位點(diǎn)rs2044456、rs4953348、rs4953361及EGLN1基

11、因位點(diǎn)rs2153364、rs479200目的基因片段進(jìn)行了測序,并未發(fā)現(xiàn)其緊鄰上下游存在其他多態(tài)性的位點(diǎn)。我們將各個選定位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率統(tǒng)計如下:EPAS1基因位點(diǎn)rs2044456、rs4953348、rs4953361均檢測出AA、AG、GG基因型。其中rs2044456位點(diǎn)A、G等位基因頻率在病例組分別為0.4、0.6,在對照組中為0.3、0.7;同樣的,rs4953348位點(diǎn)A、G等位基因頻率在病例組分別為0.15、

12、0.85,在對照組中為0.3、0.7;rs4953361位點(diǎn)A、G等位基因頻率在病例組分別為0.5、0.5,在對照組中為0.45、0.55。EGLN1基因位點(diǎn)rs2153364、rs479200均檢測出CC、CT、TT基因型。rs2153364位點(diǎn)C、T等位基因頻率在病例組中分別為0.55、0.45,在對照組中為0.35、0.65;rs479200位點(diǎn)C、T等位基因在病例組和對照組中頻率均為0.4、0.6。
　　3.我們從中選取了

13、EPAS1基因rs2044456、rs4953348位點(diǎn),在80例AMS病例組及86例對照組樣本中,采用PCR-LDR技術(shù)對其進(jìn)行基因分型檢測。并且我們對危險因素(BMI、吸煙史、飲酒史)及年齡、心率、血氧飽和度同基因型與AMS的發(fā)病情況進(jìn)行了Logistic回歸分析以排除該因素的干擾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs2044456位點(diǎn)基因型及等位基因頻率組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。rs4953348位點(diǎn)AG基因型頻率同GG基因型頻率相比組間差異

14、具有統(tǒng)計學(xué)意義(OR=0.453,95%CI0.226~0.908,P=0.026);AMS組A等位基因頻數(shù)顯著低于對照組(25.0%vs35.5%,OR=0.607,95%CI0.377~0.975,P=0.039)。提示rs4953348位點(diǎn)基因型及等位基因可能與AMS發(fā)病有關(guān)聯(lián)性。
　　4.分別比較各位點(diǎn)不同基因型心率及血氧飽和度水平,發(fā)現(xiàn)該兩個位點(diǎn)不同基因型高原心率水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。rs2044456位點(diǎn)

15、GG基因型高原血氧飽和度水平明顯高于AG基因型水平(P<0.05);而rs4953348位點(diǎn)AG基因型高原血氧飽和度水平則明顯高于GG基因型水平(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在中國平原漢族人群中,EPAS1基因rs4953348位點(diǎn)多態(tài)性同AMS發(fā)病易感性相關(guān),攜帶AG基因型的人群患AMS的風(fēng)險性可能較攜帶GG基因型人群低,而A等位基因則可能是中國平原漢族人群AMS發(fā)病的保護(hù)性因素。
　　2.EPAS1基因r