三磷酸肌醇對(duì)豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的作用研究.pdf

1、目的：大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKCa通道）在血管平滑肌細(xì)胞膜上分布廣泛，它在調(diào)節(jié)血管平滑肌張力機(jī)制中起著重要作用，BKCa通道被激活后可引起細(xì)胞膜的超極化，通過抑制L型鈣通道,降低胞內(nèi)鈣濃度而起負(fù)反饋?zhàn)饔?，引起平滑肌舒張。IP3是一種重要的胞內(nèi)第二信使物質(zhì)，有研究表明在內(nèi)臟平滑肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，IP3可以誘發(fā)胞內(nèi)IP3敏感鈣庫釋放鈣，使局部鈣濃度瞬時(shí)增加，激活與其相鄰的細(xì)胞膜上的BKCa通道，從而超極化細(xì)胞膜，導(dǎo)致平滑肌舒張。生理濃

2、度毫摩爾級(jí)ATP在胞內(nèi)IP3為高濃度時(shí),可能協(xié)助IP3, 增強(qiáng)其使胞內(nèi)鈣庫釋放鈣(IP3誘發(fā)的鈣釋放,IICR)的作用。IP3發(fā)揮作用的具體機(jī)理還沒有滿意的解釋。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用膜片鉗單通道電流記錄技術(shù)，研究了IP3對(duì)豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道的調(diào)控機(jī)制，及ATP與IP3對(duì)BKCa通道的協(xié)同作用。方法：分離豬冠狀動(dòng)脈，剔除外膜，保留平滑肌層和內(nèi)膜，縱行剖開后將其剪成2×5mm的組織塊，放入酶液經(jīng)過酶解后獲得單個(gè)平滑肌細(xì)胞，分離細(xì)胞在24

3、小時(shí)內(nèi)使用。取急性酶分離的平滑肌細(xì)胞置于對(duì)稱性高鉀溶液（［K+］O:［K+］I =140:140mM）中，用膜片鉗技術(shù)記錄單通道電流，所得電流通過膜片鉗放大器（CEZ-2300）放大，濾波（1KHz）后輸入計(jì)算機(jī)，用pCLAMP9.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。在細(xì)胞貼附式膜片和內(nèi)面向外式膜片上觀察不同濃度的IP3對(duì)BKCa通道的影響以及IP3與ATP對(duì)BKCa通道的聯(lián)合作用。結(jié)果：1．在對(duì)稱性高鉀溶液中，內(nèi)面向外式膜片（inside-

4、out）下，記錄到的豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道電導(dǎo)值為229.5±8.1pS（n=20）,具有電壓依賴性和鈣敏感性，2mM的TEA能夠在胞外完全阻斷通道活動(dòng)。改變電極液和浴液的鉀離子梯度，記錄到的單通道電流具有明顯的鉀離子選擇性。2．在細(xì)胞貼附式膜片（cell-attached）下，胞外IP3（10－60μM）對(duì)BKCa通道無明顯影響。3.在內(nèi)面向外式膜片下, 隨著胞內(nèi)IP3（10－60μM）濃度的增加，BKCa通道開放概率也相應(yīng)

5、增加，呈現(xiàn)濃度依賴性，主要是增加通道開放時(shí)間，明顯縮短通道關(guān)閉時(shí)間。在已經(jīng)加入IP3的膜片上繼續(xù)加入ATP（2mM），可使通道開放概率明顯增加，且呈多水平開放。4.在浴液鈣離子濃度接近0 mM ([EGTA]=1mM, [Ca2+]=0mM)時(shí)，IP3對(duì)BKCa通道仍有激活作用，鈣離子對(duì)IP3激活BKCa通道的作用沒有影響。5.IP3對(duì)通道的電流幅度值及電導(dǎo)值無明顯影響。結(jié)論：以上結(jié)果提示胞內(nèi)IP3對(duì)豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道具有