動脈粥樣硬化兔血管平滑肌細胞鈣激活鉀通道活性變化及川芎嗪對其作用研究.pdf

1、目的：①研究動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)時血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecells，VSMC)的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductancecalcium-activatedpotassiumchannels，Bkca)活性是否發(fā)生了變化，從而進一步探討其在AS時的病理生理意義。②研究AS時VSMCBkca對川芎嗪(ligustrazine，Lig)的反應(yīng)性，從細胞水平和分子水

2、平進一步闡明Lig的擴血管機制。 方法：1.AS模型的復(fù)制：本實驗中實驗組新西蘭兔喂以高脂飼料(由0.5％膽固醇+5％豬油+15％蛋黃粉+79.5％普通飼料組成)，3周后減去飼料中的膽固醇，再喂5周，共8周。對照組只喂普通飼料，也喂8周。兩組兔均實行單籠喂養(yǎng)，每只兔每天共喂飼料100-150g，飲水不限。 2.AS模型的鑒定：喂養(yǎng)8周的兔模型經(jīng)麻醉和抗凝處理后開胸，取胸主動脈并縱向剖開，肉眼直接觀察AS形成情況，以半定量

3、法判斷每只兔主動脈損傷程度分值并結(jié)合光鏡和電鏡檢查兔胸主動脈AS病變特點，對建立的AS模型進行鑒定。 3.兔胸主動脈平滑肌細胞分離：所取胸主動脈經(jīng)作AS模型鑒定后，余下的部分斜行剪成2mm-5mm的條塊。將組織塊放入酶液，在37℃恒溫水浴箱內(nèi)振蕩消化20-30分鐘左右，一邊消化一邊將滴有細胞懸液的玻片置于倒置相差顯微鏡下進行觀察，當(dāng)視野出現(xiàn)較多折光性好的光滑細胞時終止消化，所得細胞保存于溶液2中，靜置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?

4、 4.數(shù)據(jù)記錄：實驗采用細胞貼附式膜片(cell-attachedpatch)和內(nèi)面向外式膜片(inside-outpatch)記錄主動脈平滑肌細胞膜上Bkca單通道電活動。當(dāng)電極尖端與細胞膜表面形成高阻封接時，通過改變鉗制膜電壓，觀察并記錄通道開放活性的電壓依賴性。然后通過三維操縱器迅速將電極提出液面，在空氣中暴露2～3秒后，迅速放回浴液中，即形成inside-outpatch，再通過改變鉗制膜電壓，觀察并記錄通道開放活性的電壓依賴性

5、。最后加入不同濃度的CaCl2溶液并記錄通道開放對Ca2+敏感性。記錄完畢后用浴液對浴槽進行灌洗，在浴槽內(nèi)盛1ml浴液，然后依次向浴槽內(nèi)加入不同劑量的川芎嗪，浴液中的終濃度依次達到100、200、400、600、800ug/ml。觀察并記錄不同濃度時對Bkca的作用。 結(jié)果：1.本實驗肉眼觀察可見正常組胸主動脈內(nèi)膜光滑，未見AS病變；實驗組兔胸主動脈可見明顯的乳白色或淡黃色斑點、脂質(zhì)條紋、斑塊，大小不一，有的融合成片。所取標(biāo)本經(jīng)

6、切片HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下可見實驗組主動脈內(nèi)膜彌漫性增厚，炎性細胞浸潤，平滑肌細胞增生，泡沫細胞形成。在透射電鏡下實驗組主動脈平滑肌細胞內(nèi)可見大量空泡，表明VSMC吞噬大量脂質(zhì)后正逐步形成泡沫細胞。半定量法測得的實驗組主動脈損傷程度分值顯著大于正常組0.20±0.42VS3.70±0.68(P＜0.01，n=10)。 2.在對稱性高鉀溶液中，inside-outpatch下，記錄到兔血管平滑肌細胞Bkca的電導(dǎo)值為245.1

7、1±7.97ps(n=10)，通道具有電壓依賴性和鈣敏感性。3.AS組Bkca活性的變化：在cell-attachedpatch(膜電位為+40mv)下，AS組和對照組的平均關(guān)閉時間(closeTime，Tc)分別為24.257±5.836ms和250.398±17.996ms(P＜0.01，n=8)，開放概率(openProbability,Po)分別為0.255±0.054和0.035±0.006(P＜0.01，n=8)。在insi

8、de-outpatch下，二者的Tc為54.390±5.852ms和440.485±36.046ms(P＜0.01，n=8)，Po為0.171±0.038和0.019±0.007(P＜0.01，n=8)。因此，在這兩種膜片下，AS組Bkca的Tc顯著縮短，Po顯著增加。 3.Lig對Bkca的作用：在cell-attachedpatch下，Lig對Bkca無明顯激活作用，用藥前后通道開放概率(openProbability,Po

9、)，電流幅度值(amplitude，Am)，平均開放時間(openTime,To)和平均關(guān)閉時間(closeTime,Tc)均無明顯變化。 4.在inside-outpatch下，隨胞內(nèi)Lig濃度的增加，Bkca的開放概率也相應(yīng)增加，呈現(xiàn)濃度依賴性，主要是明顯縮短通道平均關(guān)閉時間。用不含藥物的浴液灌流洗脫藥物后，通道活動可恢復(fù)到用藥前水平，表明Lig與作用位點呈可逆性結(jié)合。5.800ug/mlLig(膜電位+40mv)可分別使A

10、S組和正常組的開放概率增加5.173±1.694倍和23.462±5.553倍(P＜0.01，n=8)。 結(jié)論：1.根據(jù)鑒定結(jié)果，實驗組兔胸主動脈已形成AS，表明高脂重膽固醇飲食有明顯致AS作用。 2.AS組兔血管平滑肌細胞Bkca的活性明顯增強。 3.在cell-attachedpatch下，Lig對Bkca無明顯激活作用。在inside-outpatch下，隨胞內(nèi)Lig濃度的增加，Bkca的開放概率也相應(yīng)增加